Оптимизация метода ПЦР для оценки паразитологического ответа у пациентов с хронической болезнью Шагаса (PCR)

Болезнь Шагаса (БК) входит в число самых игнорируемых заболеваний в мире. В Латинской Америке 21 страна является эндемичной по БК, и, по оценкам, 108 миллионов человек подвержены риску заражения этой болезнью. По оценкам 1980-х годов, было инфицировано около 16–18 миллионов человек. В 1990-х годах, после ряда многонациональных инициатив по контролю, оценки числа инфицированных людей были пересмотрены до 9,8 миллиона человек в 2001 году. Расчетное бремя болезней в пересчете на годы жизни с поправкой на инвалидность (DALY) снизилось с 2,7 миллиона в 1990 году до 586 000 в 2001 году. Недавние оценки Панамериканской организации здравоохранения (ПАОЗ) за 2006 г. указывают на 7,54 миллиона инфицированных людей и 55 185 новых случаев в год. CD, также известный как американский трипаносомоз, представляет собой зоонозное заболевание, вызываемое простейшими гемофлагеллятами Trypanosoma cruzi, которое в основном передается крупными кровососущими редувиидными клопами подсемейства Triatominae. Клинически БК человека имеет две фазы: острую и хроническую. Острая фаза, длящаяся несколько недель, представляет собой лихорадочное и токсическое заболевание, во время которого паразита можно обнаружить при непосредственном исследовании свежей крови. В хронической фазе диагноз зависит от гемокультур различной степени чувствительности, ксенодиагностики, ПЦР или обнаружения антител IgG. Без лечения хроническая фаза продолжается до конца жизни человека. Начинается без специфических симптомов или клинических проявлений в течение примерно 10–15 лет, «неопределенная форма» болезни. От 20 до 50% хронических пациентов с Шагасом в последующие годы, в зависимости от анализируемой эндемичной области, разовьют поражение сердца или желудочно-кишечного тракта. Текущая терапия целиакии ограничена двумя нитрогетероциклическими препаратами, нифуртимоксом и бензнидазолом, причем последний является наиболее широко используемым препаратом для лечения болезни Шагаса. Показаниями к лечению являются острое заболевание (включая врожденную инфекцию) и раннее хроническое заболевание (то есть у детей младше 15 лет и пациентов на ранней стадии хронической инфекции), а также реактивация инфекции путем иммуносупрессии.

Поздняя хроническая фаза лечится по усмотрению врача. В иерархии потребностей утверждалось, что пациенты в неопределенной фазе заболевания будут представлять основную целевую группу для оценки новых методов лечения. При снижении заболеваемости даже в странах с наибольшим числом новых случаев наибольшее бремя болезни приходится на пациентов в бессимптомной, хронической фазе заболевания. В Боливии, например, насчитывается не менее 200 000 детей в возрасте до 15 лет и 1 миллион взрослых, инфицированных T. cruzi, в общей сложности около 700 000 человек с неопределенной формой или бессимптомной хронической фазой. Разработка эффективного и доступного лечения для миллионов людей с текущими инфекциями и профилактика хронических осложнений признана ключевым приоритетом борьбы с болезнью при БК. Оценка излечения считается наиболее сложным аспектом лечения БК, часто приводящим к разнообразным и противоречивым результатам. Термин «паразитологическое излечение» имеет сложную интерпретацию и сложную оценку в свете необходимости полной элиминации паразитов не только из крови, но и из тканей. Клиническое излечение требует длительной оценки и часто носит неопределенный характер из-за патогенеза заболевания, при котором действие паразита, реакция хозяина и их последующие клинические проявления развиваются в течение длительного периода времени. За последние годы все больше данных указывает на сильное биологическое обоснование использования паразитологических результатов в качестве суррогатных маркеров острой и неопределенной формы болезни Шагаса. Появляется все больше свидетельств роли персистенции T. cruzi в сохранении иммунного ответа и развитии заболевания. Также недавние нерандомизированные клинические исследования с длительным наблюдением продемонстрировали положительный эффект антипаразитарной химиотерапии у больных с хроническим БК и корреляцию этих данных с результатами серологии. Поэтому в целях клинической разработки и проверки концепции было предложено использовать паразитологические и серологические тесты для оценки ответа как при остром, так и при хроническом заболевании. Отрицательный прямой мазок в конце лечения обычно считается свидетельством ответа у пациентов с острым течением. При хроническом заболевании для подтверждения серологической оценки можно использовать серийную гемокультуру, ксенодиагностику или ПЦР, а положительный паразитологический результат указывает на неэффективность лечения. Гемокультура и ксенодиагностика - это методы, которые могут иметь низкую чувствительность у хронических пациентов, они требуют надлежащих ресурсов/инфраструктуры и очень квалифицированного персонала. Что касается традиционной серологии, то у пациентов с неопределенным хроническим течением снижение титра антител может занять до 5 лет с сероконверсией в негативную, наступающей через 5-10 лет. В связи с этим предлагается проводить оценку эффективности клинических исследований при неопределенном заболевании с использованием качественной и количественной ПЦР. Тем не менее, в опубликованных исследованиях наблюдалась значительная вариабельность клинической чувствительности и специфичности ПЦР, при этом различия наблюдались в зависимости от фазы заболевания и ряда используемых методов, требующих стандартизации. В частности, были опасения относительно чувствительности ПЦР при хронической болезни Шагаса из-за низкого уровня циркулирующих паразитов и естественных колебаний паразитемии. Недавние исследования показали широкий динамический диапазон для использования ПЦР, позволяющий выполнять прямые измерения в случаях с высокой паразитарной нагрузкой, таких как пациенты с болезнью Шагаса с подавленным иммунитетом и врожденно инфицированные новорожденные, а также в случаях с низкой паразитемией, таких как пациенты в неопределенной фазе или в этиологической стадии. уход. ПЦР-тестирование также использовалось для раннего выявления реактивации T. cruzi после трансплантации сердца с документально подтвержденным обнаружением увеличения паразитарной нагрузки до постановки диагноза клинической реактивации. Кроме того, накапливаются клинические и экспериментальные данные, указывающие на определенную степень корреляции между паразитемией и тканевой инфекцией. Еще одним важным достижением последних лет стало спонсируемое TDR исследование по стандартизации и лабораторной валидации качественного ПЦР-тестирования на T. cruzi. Были выбраны стандартизированные процедуры качественной оценки ПЦР (стандартная ПЦР и ПЦР в реальном времени), дающие более высокую аналитическую чувствительность и специфичность, воспроизводимость, с низким уровнем внутри- и межаналитической изменчивости и точности. Результаты этого упражнения были представлены на встрече в Буэнос-Айресе 8 ноября, и ожидается, что они будут опубликованы в ближайшем будущем. Тем не менее, имеется ограниченная информация об эффективности лечения пациентов с хронической неопределенной болезнью Крона, и только в нескольких исследованиях для оценки паразитологического ответа применялась ПЦР. Группа экспертов по CD на трех встречах, организованных DNDi, и команда разработчиков протокола CD поддержали оценку ПЦР как маркера паразитологического ответа при неопределенном хроническом заболевании. В ходе этих дискуссий был достигнут консенсус в отношении ценности использования серийных сборов крови для качественных ПЦР-анализов с целью повышения чувствительности ПЦР-тестирования.

Данные в поддержку этой информации ограничены аргентинской когортой из 41 беременной женщины, у которых ежемесячно собирали кровь. В этой небольшой группе чувствительность ПЦР составила 60,2 % для одного сбора крови, 74 % для 2 образцов крови и 80,5 % для 3 образцов крови (A. Шиман, рукопись в процессе подготовки). Кроме того, исследование Castro, опубликованное в 2002 г., показало значительное увеличение чувствительности ПЦР с 70,0% до 81,7% при добавлении второго образца (P=0,03). Добавление третьего образца привело к незначительному увеличению чувствительности до 86,7%. К сожалению, размер выборки был небольшим, интервал отбора проб не указан, а методика качественной ПЦР не стандартизирована. Во время панельных дискуссий не было достигнуто согласия относительно точного интервала для серийного отбора проб ввиду отсутствия информации в поддержку определенного интервала для забора крови для обеспечения максимальной чувствительности. Данные, полученные при ксенодиагностике, свидетельствуют об отсутствии как циркадного ритма, так и периодичности T. cruzi у лиц с хронической чагасией. Следовательно, при определении процедур отбора проб необходимо сбалансировать выигрыш в чувствительности ПЦР и логистике/осуществимости при проведении клинических испытаний в полевых условиях. Чтобы подготовиться к будущим клиническим испытаниям БК, DNDi признает необходимость оценки и оптимизации процедур проведения ПЦР как инструмента паразитологической оценки у пациентов с хронической неопределенной формой БК. Этическое одобрение исследования будет запрошено у Наблюдательного совета по этике «Врачи без границ» и у Наблюдательного совета по этике Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Кочабамба, Боливия. Кроме того, исследование будет представлено и рассмотрено Национальной программой борьбы с Шагасом и Комитетом по этике и расследованию дел Министрио де Салуд, Боливия. Это описательное исследование, целью которого является оценка того, могут ли множественные процедуры забора крови методом ПЦР на исходном уровне обеспечить более высокую чувствительность по сравнению с однократным отбором проб, а также их осуществимость в полевых условиях. Забор крови для исходного уровня и EOT будет следующим: один первоначальный образец крови объемом 10 мл (образец 1), за которым следует 1 образец крови объемом 5 мл, собранный сразу после него (образец 2); плюс один образец крови объемом 10 мл, собранный через 1 неделю (образец 3). Всего 3 пробы крови. При контрольных визитах через 6 и 12 месяцев будет использоваться только оптимальная стратегия отбора проб в EOT.

Стратегии выборки:

Для изучения чувствительности ПЦР в зависимости от количества образцов крови результаты ПЦР будут анализироваться как по отдельности, так и на этапе анализа данных путем объединения результатов ПЦР для пациентов в заданный момент времени.

• Используемая ссылка Текущая стратегия (CS): Образец 1: Один образец объемом 10 мл Могут быть разработаны два основных типа стратегий, которые нуждаются в оценке:
• Стратегия подкрепления (RS), которая заключается в добавлении проб крови к текущему подходу с одной пробой (объемом 10 мл). Если дополнительные выборки не позволяют выявить дополнительные ПЦР-позитивные случаи (что маловероятно), такая стратегия неизбежно будет более чувствительной, чем текущая.
• Стратегия замещения (SS), которая заключается в замене текущего подхода (проба 1 = 10 мл) отбором проб объемом 5 мл (проба 2) и, возможно, дальнейшим отбором проб (проба 3). Эти стратегии не обязательно лучше текущей.

Учебный сайт:

Настоящее исследование будет проводиться в сельских общинах муниципалитетов Айкиле, Омереке и Пасорапа в провинции Нарцисо Камперо, Боливия, где организация «Врачи без границ» учредила программу «Профилактика, диагностика и лечение болезни Шагаса» в партнерстве с местными органы здравоохранения. Местное население составляет ~ 40 000 человек, проживающих в одном из районов с самым высоким бременем БК в стране. В контексте этой программы лица, проживающие в сельских районах, будут обследованы на предмет болезни Шагаса, и те, кто соответствует установленным требованиям, будут приглашены для участия в исследовании. MSF и ее партнеры предоставят равные возможности для лечения и ведения болезни всем пациентам с положительным результатом теста Шагаса, независимо от того, участвовали они в исследовании или нет.

Основные критерии входа:

Включение/исключение Пациенты с хроническим БК, которым показано лечение бензнидазолом. Пациенты должны соответствовать следующим критериям приемлемости для включения в исследование:

Критерии включения:

• Возраст от > 18 до 60 лет
• Диагностика инфекции T. cruzi с помощью серологии Шагаса. Два из трех серологических тестов должны быть положительными (обычный ИФА, рекомбинантный ИФА или ИСМП).
• Письменная форма информированного согласия

Критерий исключения:

• Женщины репродуктивного возраста с положительным тестом на беременность при скрининге или кормящие грудью
• Текущее представление о серьезном состоянии здоровья, таком как: активный туберкулез легких и клинические признаки печеночной или почечной недостаточности.
• Кардиомиопатия Шагаса II, III и IV стадии (по классификации NYHA)
• Субъекты, нуждающиеся в имплантации кардиостимулятора или других серьезных дефектах сердечной проводимости
• Лечение целиакии бензнидазолом или нифуртимоксом в анамнезе в любое время в прошлом
• Неспособность соблюдать последующее наблюдение и/или отсутствие постоянного адреса
• Злоупотребление алкоголем или любая другая наркотическая зависимость в анамнезе. Примечание: все пациенты, участвующие в этом исследовании, будут получать бензнидазол по 5 мг/кг/день перорально два раза в день в течение 60 дней в соответствии с обычной медицинской помощью, предоставляемой MSF в сельских общинах Айкиле. Это лечение соответствует местным рекомендациям Министерства здравоохранения и депортации Боливии. Участие пациента в этом исследовании является добровольным, и его отказ или отзыв согласия в любое время в ходе исследования не повлияет на его/ее право на получение лечения от болезни Шагаса.