Optimalizace techniky PCR k posouzení parazitologické odpovědi u pacientů s chronickou Chagasovou chorobou (PCR)

Chagasova nemoc (CD) patří mezi celosvětově nejvíce opomíjené nemoci. V Latinské Americe je endemickým výskytem CD 21 zemí s odhadem 108 milionů lidí ohrožených touto chorobou. Odhady z 80. let 20. století naznačovaly, že bylo infikováno asi 16 až 18 milionů jedinců. V 90. letech, po řadě nadnárodních kontrolních iniciativ, byly odhady počtu nakažených v roce 2001 revidovány na 9,8 milionu. Odhadovaná zátěž nemocí z hlediska počtu let života přizpůsobených zdravotnímu postižení (DALY) klesla z 2,7 milionu v roce 1990 na 586 000 v roce 2001. Nedávné odhady Panamerické zdravotnické organizace (PAHO) z roku 2006 uvádějí 7,54 milionu infikovaných lidí a 55 185 nových případů ročně. CD, také známá jako americká trypanosomiáza, je zoonotické onemocnění způsobené prvokem hemoflagelát Trypanosoma cruzi, který je přenášen hlavně velkými, krev sajícími, reduviidními brouky z podčeledi Triatominae. Klinicky má lidská CD dvě fáze, akutní a chronickou. Akutní fáze, která trvá několik týdnů, je horečnaté a toxikologické onemocnění, při kterém lze parazita odhalit přímým vyšetřením čerstvé krve. V chronické fázi je diagnóza závislá na hemokulturách různého stupně citlivosti, xenodiagnóze, PCR nebo průkazu IgG protilátek. Neléčená chronická fáze pokračuje po zbytek života člověka. Začíná bez specifických symptomů nebo klinických projevů po dobu přibližně 10 nebo 15 let, jde o „neurčitou formu“ nemoci. Asi u 20 až 50 % chronických pacientů s Chagasem se v průběhu následujících let v závislosti na analyzované endemické oblasti rozvine postižení srdce nebo gastrointestinálního traktu. Současná terapie CD je omezena na dvě nitroheterocyklická léčiva, Nifurtimox a Benznidazol, přičemž později je nejrozšířenějším léčivem pro léčbu Chagasovy choroby. Indikacemi k léčbě jsou akutní onemocnění (včetně vrozené infekce) a časné chronické onemocnění (tj. u dětí < 15 let a pacientů v časné fázi chronické infekce) plus reaktivace infekce imunosupresí.

Pozdní chronická fáze je léčena podle uvážení lékaře. V hierarchii potřeb se tvrdilo, že pacienti v neurčité fázi onemocnění by představovali hlavní cílovou populaci pro hodnocení nových léčebných postupů. S klesající incidencí onemocnění i v zemích s nejvyšším počtem nových případů je nejvyšší nemocnostní zátěž u pacientů v asymptomatické, chronické fázi onemocnění. Například Bolívie má nejméně 200 000 dětí ve věku do 15 let a 1 milion dospělých infikovaných T. cruzi, což je odhadovaný celkový počet 700 000 lidí s neurčitou formou nebo asymptomatickou, chronickou fází. Vývoj účinné a dostupné léčby pro miliony lidí s probíhajícími infekcemi a prevence chronických komplikací je u CD považována za klíčovou prioritu kontroly onemocnění. Hodnocení vyléčení je považováno za nejkomplexnější aspekt léčby CD, což vede k často různorodým a kontroverzním výsledkům. Pojem parazitologická léčba je složitý na výklad a náročné hodnocení vzhledem k nutnosti úplné eliminace parazitů nejen z krve, ale i z tkání. Klinická léčba vyžaduje dlouhodobé hodnocení a je často nejistého charakteru vzhledem k patogenezi onemocnění, přičemž působení parazita, reakce hostitele a jejich následné klinické projevy se vyvíjejí dlouhou dobu. V posledních letech narůstající množství dat poukázalo na silný biologický důvod pro použití parazitologických výsledků jako náhradních markerů pro akutní a neurčitou Chagasovu chorobu. Existuje stále více důkazů o úloze perzistence T. cruzi v udržování imunitní odpovědi a vývoji onemocnění. Rovněž nedávné nerandomizované klinické studie s dlouhodobým sledováním prokázaly pozitivní efekt antiparazitární chemoterapie u pacientů s chronickou CD a korelaci těchto nálezů se sérologickými výsledky. Proto bylo pro účely klinického vývoje a prokázání koncepce navrženo, aby byly parazitologické a sérologické testy použity pro hodnocení odpovědi jak u akutních, tak u chronických onemocnění. Negativní přímý stěr na konci léčby je obecně přijímán jako důkaz odpovědi u akutních pacientů. U chronického onemocnění lze k podpoře sérologického hodnocení použít sériovou hemokultivaci, xenodiagnostiku nebo PCR a pozitivní parazitologický výsledek indikuje selhání léčby. Hemokultura a xenodiagnostika jsou techniky, které mohou u chronických pacientů představovat nízkou senzitivitu, vyžadují řádné zdroje/infrastrukturu a velmi zručný personál. Pokud jde o konvenční sérologii, u neurčitých chronických pacientů může pokles titrů protilátek trvat až 5 let, přičemž sérokonverze na negativní nastává po 5-10 letech. V důsledku toho se navrhuje, aby hodnocení účinnosti pro klinické studie u neurčitého onemocnění bylo provedeno s použitím kvalitativní a kvantitativní PCR. V publikovaných studiích však došlo k významné variabilitě v klinické senzitivitě a specificitě PCR, přičemž rozdíly byly pozorovány napříč fázemi onemocnění a řada používaných technik vyžaduje standardizaci. Zejména existují obavy ohledně citlivosti PCR u chronické Chagasovy choroby kvůli nízkým hladinám cirkulujících parazitů a přirozeným výkyvům parazitémie. Nejnovější studie ukázaly široký dynamický rozsah pro použití PCR, což umožňuje přímé měření v případech s vysokou parazitární zátěží, jako jsou pacienti s imunosuprimovanou Chagasovou chorobou a vrozeně infikovaní novorozenci, stejně jako v případech s nízkou parazitémií, jako jsou pacienti v neurčité fázi nebo v etiologickém léčba. Testování PCR bylo také použito pro časnou detekci reaktivace T. cruzi po transplantaci srdce, s dokumentovanou detekcí zvýšení parazitární zátěže před diagnózou klinické reaktivace. Kromě toho existují narůstající klinická a experimentální data naznačující stupeň korelace mezi parazitémií a tkáňovou infekcí. Dalším důležitým pokrokem v posledních letech byla sponzorovaná studie TDR pro standardizaci a laboratorní validaci kvalitativního PCR testování na T. cruzi. Byly zvoleny standardizované postupy pro kvalitativní hodnocení PCR (standardní a real-time PCR) poskytující vyšší analytickou senzitivitu a specificitu, reprodukovatelnost s nízkou úrovní variability a přesnosti uvnitř a mezi testy. Výsledky tohoto cvičení byly prezentovány na schůzce v Buenos Aires 8. listopadu a očekává se, že budou zveřejněny v blízké budoucnosti. Existují však omezené informace o účinnosti léčby u pacientů s chronickou neurčitou CD a pouze několik studií použilo k posouzení parazitologické odpovědi PCR. Panel odborníků na CD na třech setkáních pořádaných DNDi a týmem pro vývoj protokolu CD podpořil hodnocení PCR jako markeru parazitologické odpovědi u neurčitého chronického onemocnění. Během těchto diskusí došlo ke shodě ohledně hodnoty použití sériových odběrů krve pro kvalitativní PCR testy, aby se zvýšila citlivost PCR testování.

Údaje na podporu této informace jsou omezeny na argentinskou kohortu 41 těhotných žen, které byly sledovány měsíčními odběry krve. V této malé skupině byla citlivost PCR 60,2 % pro jeden odběr, 74 % pro 2 odběry krve a 80,5 % pro 3 odběry krve (A. Schijman, připravovaný rukopis). Studie od Castra publikovaná v roce 2002 navíc naznačila významné zvýšení citlivosti PCR ze 70,0 % na 81,7 % s přidáním druhého vzorku (P=0,03). Přidání třetího vzorku vedlo k nevýznamnému zvýšení citlivosti na 86,7 %. Bohužel velikost vzorku byla malá, nebyl uveden žádný interval odběru vzorků a kvalitativní PCR technika byla nestandardizovaná. Během panelových diskusí nedošlo k dohodě o přesném intervalu sériového odběru vzorků vzhledem k nedostatku informací, které by podporovaly určitý interval odběru krve, aby se maximalizovala citlivost. Údaje získané pomocí xenodiagnostiky naznačují absenci jak cirkadiánního rytmu, tak periodicity T. cruzi u chronických chagasických jedinců. Při definování postupů odběru vzorků by proto bylo potřeba vyvážit zisk z citlivosti PCR a logistiky/proveditelnosti při provádění klinických studií v terénu. V rámci přípravy na budoucí klinické studie CD DNDi uznává potřebu vyhodnotit a optimalizovat postupy pro implementaci PCR jako nástroje parazitologického hodnocení u pacientů s chronickou neurčitou formou CD. Etické schválení studie bude požadováno od Rady pro etické hodnocení Lékařů bez hranic a od Rady pro etické hodnocení od Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolívie. Kromě toho bude studie předložena a přezkoumána Národním programem kontroly Chagas a 'Comité de Ética e Investigación' del Ministerio de Salud, Bolívie. Jedná se o popisnou studii, jejímž cílem je posoudit, zda vícenásobné postupy odběru vzorků krve PCR na začátku mohou poskytnout vyšší citlivost ve srovnání s jedním odběrem vzorků, a také jejich proveditelnost v terénu. Odběr krve pro základní linii a EOT bude následující: jeden počáteční vzorek krve o objemu 10 ml (vzorek 1), následovaný 1 vzorkem krve o objemu 5 ml odebraný bezprostředně poté (vzorek 2); plus jeden vzorek krve o objemu 10 ml odebraný o 1 týden později (vzorek 3). Celkem 3 vzorky krve. Při následných návštěvách po 6 a 12 měsících bude použita pouze optimální strategie odběru vzorků při EOT.

Strategie vzorkování:

Aby bylo možné prozkoumat citlivost PCR podle počtu vzorků krve, budou výsledky PCR analyzovány jako jednotlivé testy a také ve fázi analýzy dat kombinací výsledků PCR pro pacienty v daném časovém bodě.

• Použitý odkaz Současná strategie (CS): Vzorek 1: Jediný vzorek o objemu 10 ml Mohou být vyvinuty dva hlavní typy strategií, které vyžadují posouzení:
• Strategie posílení (RS), která spočívá v přidání odběru krve k současnému přístupu s jedním odběrem (objem 10 ml). Pokud další odběry vzorků neumožní detekci dalších PCR-pozitivních případů (což je nepravděpodobné), bude taková strategie nevyhnutelně citlivější než ta současná.
• Substituční strategie (SS), která spočívá v nahrazení stávajícího přístupu (vzorek 1 = 10 ml) odběrem 5 ml (vzorek 2) a případně dalším odběrem (vzorky) (vzorek 3). Tyto strategie nemusí být nutně lepší než ta současná.

Studijní web:

Tato studie bude provedena ve venkovských komunitách v obcích Aiquile, Omereque a Pasorapa v provincii Narciso Campero v Bolívii, kde Lékaři bez hranic zavedli program „prevence, diagnostiky a léčby Chagasovy choroby“ ve spolupráci s místními zdravotnických úřadů. Místní populace je ~ 40 000 jedinců, kteří žijí v jedné z oblastí s nejvyšší zátěží CD v zemi. V rámci tohoto programu budou jednotlivci žijící ve venkovských komunitách podrobeni screeningu na Chagasovu chorobu a ti, kteří splňují způsobilost, budou pozváni k účasti na studii. Lékaři bez hranic a jejich partneři poskytnou rovné příležitosti pro léčbu a zvládání nemoci všem subjektům pozitivním na Chagas, a to bez ohledu na to, zda se studie účastní či nikoli.

Hlavní vstupní kritéria:

Zařazení / Vyloučení Pacienti s chronickou CD, kteří mají indikaci k léčbě benznidazolem. Pacienti musí splňovat následující kritéria způsobilosti pro zařazení do studie:

Kritéria pro zařazení:

• Věk > 18 - 60 let
• Diagnostika infekce T. cruzi Chagasovou sérologií. Dva ze tří sérologických testů musí být pozitivní (konvenční ELISA, rekombinantní ELISA nebo HAI)
• Písemný formulář informovaného souhlasu

Kritéria vyloučení:

• Ženy v reprodukčním věku, které mají pozitivní těhotenský test při screeningu, nebo které kojí Poznámka: Ženy v reprodukčním věku musí souhlasit s používáním antikoncepční metody během celé léčebné fáze studie
• Současná prezentace závažného zdravotního stavu, jako je: aktivní plicní tuberkulóza a klinické příznaky selhání jater nebo ledvin.
• Chagasova kardiomyopatie stadia II, III a IV (podle klasifikace NYHA)
• Subjekty vyžadující implantaci kardiostimulátoru nebo jiné závažné poruchy srdečního vedení
• Historie léčby CD benznidazolem nebo nifurtimoxem kdykoli v minulosti
• Neschopnost dodržet následnou kontrolu a/nebo nemít trvalé bydliště
• Anamnéza zneužívání alkoholu nebo jakékoli jiné drogové závislosti Poznámka: všichni pacienti účastnící se této studie budou léčeni benznidazolem, 5 mg/kg/den PO BID po dobu 60 dnů, podle běžné péče poskytované Lékaři bez hranic ve venkovských komunitách v Aiquile. Tato léčba je v souladu s místními doporučeními od Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. Účast pacienta v této studii je dobrovolná a jeho odmítnutí nebo odvolání souhlasu kdykoli během studie neovlivní jeho/její právo na léčbu Chagasovy choroby.