Optimering af PCR-teknik til at vurdere parasitologisk respons for patienter med kronisk Chagas sygdom (PCR)

Chagas sygdom (CD) er blandt verdens mest oversete sygdomme. I Latinamerika er 21 lande endemiske for CD med anslået 108 millioner mennesker i risiko for at pådrage sig sygdommen. Skøn fra 1980'erne viste, at omkring 16-18 millioner individer var inficeret. I 1990'erne, efter en række multinationale kontrolinitiativer, blev estimater af antallet af inficerede mennesker revideret til 9,8 millioner i 2001. Den anslåede sygdomsbyrde i form af handicapjusterede leveår (DALYs) faldt fra 2,7 millioner i 1990 til 586.000 i 2001. Nylige estimater fra Pan-American Health Organization (PAHO), 2006 indikerer 7,54 millioner inficerede mennesker og 55.185 nye tilfælde om året. CD, også kendt som amerikansk trypanosomiasis, er en zoonotisk sygdom forårsaget af den protozoiske hæmoflagelat Trypanosoma cruzi, der hovedsageligt overføres af store, blodsugende, reduviide insekter fra underfamilien Triatominae. Klinisk har human CD to faser, akut og kronisk. Den akutte fase, som varer et par uger, er en febril og toksæmisk sygdom, hvor parasitten kan påvises ved direkte undersøgelse af frisk blod. I den kroniske fase afhænger diagnosen af ​​hæmokulturer af varierende grad af følsomhed, xenodiagnose, PCR eller påvisning af IgG-antistoffer. Ubehandlet fortsætter den kroniske fase resten af ​​en persons liv. Det begynder uden specifikke symptomer eller kliniske manifestationer i en periode på cirka 10 eller 15 år, den "ubestemte form" af sygdommen. Omkring 20 til 50 % af kroniske Chagas-patienter i løbet af de efterfølgende år, afhængigt af det endemiske område, der analyseres, vil udvikle involvering af hjertet eller mave-tarmkanalen. Nuværende behandling for CD er begrænset til to nitroheterocykliske lægemidler, Nifurtimox og Benznidazol, hvor det senere er det mest udbredte lægemiddel til behandling af Chagas sygdom. Indikationerne for behandling er akut sygdom (herunder medfødt infektion) og tidlig kronisk sygdom (dvs. hos børn < 15 år og patienter i den tidlige fase af kronisk infektion) plus reaktivering af infektionen ved immunsuppression.

Sen kronisk fase behandles efter klinikerens skøn. I et behovshierarki er det blevet hævdet, at patienter i den ubestemte fase af sygdommen ville repræsentere hovedmålgruppen for evaluering af nye behandlinger. Med faldende forekomst af sygdommen, selv i lande med det højeste antal nye tilfælde, er den højeste sygdomsbyrde blandt patienter i den asymptomatiske, kroniske fase af sygdommen. Bolivia har for eksempel mindst 200.000 børn under 15 år og 1 million voksne inficeret med T. cruzi, for et anslået i alt 700.000 mennesker med den ubestemte form eller asymptomatiske, kroniske fase. Udviklingen af ​​effektiv og økonomisk overkommelig behandling for millioner af mennesker med igangværende infektioner og forebyggelse af kroniske komplikationer er anerkendt som en nøgleprioritet for sygdomsbekæmpelse i CD. Evalueringen af ​​helbredelse betragtes som det mest komplekse aspekt af behandling ved CD, hvilket fører til ofte forskellige og kontroversielle resultater. Begrebet parasitologisk helbredelse er vanskeligt at fortolke og evalueringen udfordrende i lyset af behovet for total eliminering af parasitter ikke kun fra blod, men også fra væv. Klinisk helbredelse kræver langsigtet evaluering og er ofte af usikker karakter på grund af sygdommens patogenese, hvor parasittens virkning, værtens respons og deres deraf følgende kliniske manifestationer udvikler sig over længere tid. I de senere år har en stigende mængde data peget på en stærk biologisk begrundelse for brugen af ​​parasitologiske resultater som surrogatmarkører for akut og ubestemt Chagas sygdom. Der er stigende beviser for den rolle, som T. cruzi-persistens spiller i opretholdelsen af ​​immunrespons og udvikling af sygdommen. Nylige ikke-randomiserede kliniske forsøg med langtidsopfølgning har også vist en positiv effekt fra antiparasitisk kemoterapi hos patienter med kronisk CD og korrelationen af ​​disse fund med serologiske resultater. Derfor er det med henblik på klinisk udvikling og proof-of-concept blevet foreslået, at parasitologiske og serologiske tests anvendes til vurdering af respons ved både akut og kronisk sygdom. En negativ direkte udstrygning ved afslutningen af ​​behandlingen accepteres generelt som tegn på respons hos akutte patienter. Ved kronisk sygdom kan seriel hæmokultur, xenodiagnose eller PCR bruges til at understøtte serologisk vurdering, og et positivt parasitologisk resultat indikerer behandlingssvigt. Hæmokultur og xenodiagnose er teknikker, der kan give lav følsomhed hos kroniske patienter, de kræver passende ressourcer/infrastruktur og meget dygtigt personale. Med hensyn til konventionel serologi, med ubestemmelige kroniske patienter, kan et fald i antistoftitre tage op til 5 år med serokonvertering til negativ efter 5-10 år. Som følge heraf foreslås det, at effektvurdering af kliniske studier i ubestemt sygdom foretages ved brug af kvalitativ og kvantitativ PCR. Der har dog været betydelig variation i den kliniske sensitivitet og specificitet af PCR i publicerede undersøgelser, med forskelle set på tværs af faser af sygdommen og en række teknikker i brug, der kræver standardisering. Der har især været bekymring med hensyn til følsomheden af ​​PCR ved kronisk Chagas sygdom på grund af de lave niveauer af cirkulerende parasitter og naturlige udsving i parasitæmien. Seneste undersøgelser har vist et bredt dynamisk område for PCR-brug, hvilket muliggør direkte målinger i tilfælde med høj parasitbelastning, såsom patienter med immunsupprimeret Chagas sygdom og medfødt inficerede nyfødte, såvel som i tilfælde med lav parasitæmi, såsom patienter i den ubestemte fase eller under ætiologisk behandling. PCR-test er også blevet brugt til tidlig påvisning af T. cruzi-reaktivering efter hjertetransplantation, med dokumenteret påvisning af parasitisk belastningsforøgelse, før diagnosen klinisk reaktivering. Derudover er der påløbende kliniske og eksperimentelle data, der tyder på en grad af korrelation mellem parasitæmi og vævsinfektion. Et andet vigtigt fremskridt i de senere år har været det TDR-sponsorerede studie til standardisering og laboratorievalidering af kvalitativ PCR-testning for T. cruzi. Standardiserede procedurer til kvalitativ vurdering af PCR (standard og real-time PCR), der giver højere analytisk sensitivitet og specificitet, reproducerbarhed, med lave niveauer af intra- og inter-assay variation og nøjagtighed er blevet udvalgt. Resultater fra denne øvelse er blevet præsenteret på et møde i Buenos Aires den 8. november, og de forventes at blive offentliggjort i den nærmeste fremtid. Der er imidlertid begrænset information om effektiviteten af ​​behandling for kroniske ubestemte CD-patienter, og kun få undersøgelser anvendte PCR til at vurdere parasitologisk respons. Et panel af eksperter i CD gav ved tre møder arrangeret af DNDi og CD-protokoludviklingsteamet støtte til evalueringen af ​​PCR som en markør for parasitologisk respons ved ubestemmelig kronisk sygdom. Under disse diskussioner var der konsensus om værdien af ​​at bruge serielle blodprøver til kvalitative PCR-assays for at øge PCR-testfølsomheden.

Data til støtte for disse oplysninger er begrænset til en argentinsk kohorte på 41 gravide kvinder, der følges op med månedlige blodprøvetagninger. I denne lille gruppe var PCR-følsomheden 60,2 % for en enkelt blodprøvetagning, 74 % for 2 blodprøvetagninger og 80,5 % for 3 blodprøvetagninger (A. Schijman, manuskript under forberedelse). Derudover indikerede en undersøgelse fra Castro offentliggjort i 2002 en signifikant stigning fra 70,0 % til 81,7 % i følsomheden af ​​PCR med tilføjelse af en anden prøve (P=0,03). Tilføjelsen af ​​en tredje prøve førte til ikke-signifikant stigning i følsomheden til 86,7 %. Desværre var prøvestørrelsen lille, der var ingen indikation af prøvetagningsintervallet, og den kvalitative PCR-teknik var ikke-standardiseret. Under paneldiskussionerne var der ikke enighed om det præcise interval for seriel prøveudtagning i lyset af manglen på information til støtte for et bestemt interval for blodprøvetagning for at maksimere følsomheden. Data opnået med xenodiagnose tyder på fraværet af både døgnrytme og T. cruzi-periodicitet hos kroniske chagasiske individer. Når man definerer prøveudtagningsprocedurer, vil man derfor skulle afbalancere gevinsten på PCR-følsomheden og logistik/gennemførlighed ved at udføre kliniske forsøg i felten. For at forberede sig på fremtidige kliniske forsøg på CD, anerkender DNDi behovet for at evaluere og optimere procedurerne for PCR-implementering som et værktøj til parasitologisk vurdering hos patienter med kronisk ubestemt form for CD. Studieetisk godkendelse vil blive søgt fra Læger uden Grænser Ethical Review Board og Ethical Review Board fra Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolivia. Desuden vil undersøgelsen blive indsendt og gennemgået af det nationale Chagas kontrolprogram og 'Comité de Ética e Investigación' del Ministerio de Salud, Bolivia. Dette er en beskrivende undersøgelse, der har til formål at vurdere, om flere PCR-blodprøvetagningsprocedurer ved baseline kan give højere følsomhed sammenlignet med enkelt prøvetagning, såvel som deres gennemførlighed i felten. Blodprøvetagning for baseline og EOT vil være som følger: én indledende blodprøve på 10 mL (prøve 1), efterfulgt af 1 blodprøve på 5 mL opsamlet umiddelbart efter (prøve 2); plus en blodprøve på 10 mL indsamlet 1 uge senere (prøve 3). I alt 3 blodprøver. Ved 6 og 12 måneders opfølgningsbesøg vil kun den optimale prøveudtagningsstrategi på EOT blive brugt.

Prøveudtagningsstrategier:

For at udforske PCR-følsomheden i overensstemmelse med antallet af blodprøver, vil PCR-resultater blive analyseret som enkeltanalyser samt, på dataanalysestadiet, ved at kombinere PCR-resultater for patienter på et givet tidspunkt.

• Reference, der skal bruges Nuværende strategi (CS): Prøve 1: Enkeltprøve på 10 ml To hovedtyper af strategier kan udvikles og kræver en vurdering:
• Forstærkningsstrategi (RS), der består i at tilføje blodprøve(r) til den nuværende enkeltprøvemetode (volumen på 10 ml). Medmindre yderligere prøvetagninger ikke tillader påvisning af yderligere PCR-positive tilfælde (hvilket er usandsynligt), vil en sådan strategi uundgåeligt være mere følsom end den nuværende.
• Substitutionsstrategi (SS), der består i at erstatte den nuværende tilgang (prøve 1 = 10 ml) med en 5 ml prøveudtagning (prøve 2) og eventuelt yderligere prøveudtagning(er) (prøve 3). Disse strategier er ikke nødvendigvis bedre end den nuværende.

Studiested:

Denne undersøgelse vil blive udført i landdistrikter i kommunerne Aiquile, Omereque og Pasorapa i provinsen Narciso Campero, Bolivia, hvor Læger uden Grænser har etableret et program for "Chagas sygdomsforebyggelse, diagnose og behandling" i samarbejde med de lokale sundhedsmyndighederne. Den lokale befolkning er ~ 40.000 individer, der bor i et af de områder med den højeste byrde af CD i landet. I forbindelse med dette program vil de personer, der bor i landdistrikter, blive screenet for Chagas sygdom, og de, der opfylder berettigelsen, vil blive inviteret til at deltage i undersøgelsen. Lige muligheder for behandling og håndtering af sygdommen vil blive givet af Læger uden Grænser og dets partnere til alle Chagas-positive forsøgspersoner, på trods af deltagelse eller ej i undersøgelsen.

Hovedindgangskriterier:

Inklusion / Eksklusion Patienter med kronisk CD, der har indikation for behandling med benznidazol. Patienter skal opfylde følgende kriterier for tilmelding til undersøgelsen:

Inklusionskriterier:

• Alder mellem > 18 - 60 år
• Diagnose af T. cruzi-infektion ved Chagas-serologi. To ud af tre serologiske test skal være positive (konventionel ELISA, rekombinant ELISA eller HAI)
• Skriftlig informeret samtykkeformular

Ekskluderingskriterier:

• Kvinder i den fødedygtige alder, som har en positiv graviditetstest ved screening, eller som ammer Bemærk: Kvinder i den fødedygtige alder skal acceptere at bruge en præventionsmetode under hele forsøgets behandlingsfase
• Aktuel præsentation af alvorlig helbredstilstand såsom: aktiv lungetuberkulose og kliniske tegn på lever- eller nyresvigt.
• Chagas kardiomyopati stadium II, III og IV (ifølge NYHA klassifikationen)
• Personer, der kræver pacemakerimplantation eller andre alvorlige hjerteledningsfejl
• Anamnese med CD-behandling med benznidazol eller nifurtimox på noget tidligere tidspunkt
• Manglende evne til at overholde opfølgning og/eller ikke have fast adresse
• Anamnese med alkoholmisbrug eller anden stofmisbrug Bemærk: alle patienter, der deltager i denne undersøgelse, vil blive behandlet med Benznidazol, 5 mg/kg/dag PO BID i 60 dage, i henhold til rutinemæssig behandling fra Læger uden Grænser i landdistrikterne i Aiquile. Denne behandling er i overensstemmelse med de lokale anbefalinger fra Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. Patientens deltagelse i denne undersøgelse er frivillig, og hans afvisning eller tilbagetrækning af samtykke på et hvilket som helst tidspunkt under undersøgelsen vil ikke påvirke hans/hendes ret til at modtage behandling for Chagas sygdom.