Optimisation de la technique PCR pour évaluer la réponse parasitologique des patients atteints de la maladie chronique de Chagas (PCR)

La maladie de Chagas (MC) se classe parmi les maladies les plus négligées au monde. En Amérique latine, 21 pays sont endémiques pour la MC avec environ 108 millions de personnes à risque de contracter la maladie. Les estimations des années 1980 indiquaient que quelque 16 à 18 millions de personnes étaient infectées. Dans les années 1990, après une série d'initiatives multinationales de contrôle, les estimations du nombre de personnes infectées ont été révisées à 9,8 millions en 2001. La charge de morbidité estimée en termes d'années de vie ajustées sur l'incapacité (DALY) est passée de 2,7 millions en 1990 à 586 000 en 2001. Des estimations récentes de l'Organisation panaméricaine de la santé (OPS), 2006, indiquent 7,54 millions de personnes infectées et 55 185 nouveaux cas par an. La MC, également connue sous le nom de trypanosomiase américaine, est une maladie zoonotique causée par le protozoaire hémoflagellé Trypanosoma cruzi qui est principalement transmise par de gros insectes réduvidés suceurs de sang de la sous-famille des Triatominae. Cliniquement, la MC humaine comporte deux phases, aiguë et chronique. La phase aiguë, qui dure quelques semaines, est une maladie fébrile et toxémique, au cours de laquelle le parasite peut être détecté par examen direct du sang frais. Dans la phase chronique, le diagnostic repose sur des hémocultures plus ou moins sensibles, le xénodiagnostic, la PCR ou la détection des anticorps IgG. Non traitée, la phase chronique continue pour le reste de la vie d'une personne. Elle débute sans symptômes ni manifestations cliniques spécifiques pendant une période d'environ 10 ou 15 ans, la « forme indéterminée » de la maladie. Environ 20 à 50% des patients chroniques de Chagas au cours des années suivantes, selon la zone d'endémie analysée, développeront une atteinte du cœur ou du tractus gastro-intestinal. Le traitement actuel de la MC se limite à deux médicaments nitrohétérocycliques, le nifurtimox et le benznidazole, ce dernier étant le médicament le plus largement utilisé pour le traitement de la maladie de Chagas. Les indications de traitement sont les maladies aiguës (y compris les infections congénitales) et les maladies chroniques précoces (c'est-à-dire chez les enfants de < 15 ans et les patients en phase précoce d'infection chronique), ainsi que la réactivation de l'infection par immunosuppression.

La phase chronique tardive est traitée à la discrétion du clinicien. Dans une hiérarchie des besoins, il a été avancé que les patients en phase indéterminée de la maladie représenteraient la principale population cible pour l'évaluation des nouveaux traitements. Avec une incidence décroissante de la maladie, même dans les pays où le nombre de nouveaux cas est le plus élevé, la charge de morbidité la plus élevée concerne les patients en phase chronique asymptomatique de la maladie. La Bolivie, par exemple, compte au moins 200 000 enfants de moins de 15 ans et 1 million d'adultes infectés par T. cruzi, pour un total estimé à 700 000 personnes atteintes de la forme indéterminée ou de la phase chronique asymptomatique. Le développement de traitements efficaces et abordables pour les millions de personnes souffrant d'infections persistantes et la prévention des complications chroniques sont reconnus comme une priorité clé de la lutte contre la maladie dans la MC. L'évaluation de la guérison est considérée comme l'aspect le plus complexe du traitement de la MC, conduisant à des résultats souvent divers et controversés. Le terme de guérison parasitologique est d'interprétation difficile et l'évaluation difficile, à la lumière de la nécessité d'une élimination totale des parasites non seulement du sang mais aussi des tissus. La guérison clinique exige une évaluation à long terme et est souvent de nature incertaine en raison de la pathogenèse de la maladie, de l'action du parasite, de la réponse de l'hôte et de leurs manifestations cliniques consécutives évoluant sur une longue période. Au cours des dernières années, un nombre croissant de données a mis en évidence une justification biologique solide pour l'utilisation des résultats parasitologiques comme marqueurs de substitution pour la maladie de Chagas aiguë et indéterminée. Il y a de plus en plus de preuves du rôle de la persistance de T. cruzi dans la perpétuation de la réponse immunitaire et l'évolution de la maladie. De plus, de récents essais cliniques non randomisés avec un suivi à long terme ont démontré un effet positif de la chimiothérapie antiparasitaire chez les patients atteints de MC chronique et la corrélation de ces résultats avec les résultats sérologiques. Par conséquent, à des fins de développement clinique et de preuve de concept, il a été suggéré que des tests parasitologiques et sérologiques soient utilisés pour l'évaluation de la réponse dans les maladies aiguës et chroniques. Un frottis direct négatif à la fin du traitement est généralement accepté comme preuve de réponse chez les patients aigus. Dans les maladies chroniques, l'hémoculture en série, le xénodiagnostic ou la PCR peuvent être utilisés pour soutenir l'évaluation sérologique et un résultat parasitologique positif indique un échec du traitement. L'hémoculture et le xénodiagnostic sont des techniques qui peuvent présenter une faible sensibilité chez les patients chroniques, elles nécessitent des ressources/infrastructures adéquates et un personnel très compétent. En ce qui concerne la sérologie conventionnelle, chez les patients chroniques indéterminés, une diminution des titres d'anticorps peut prendre jusqu'à 5 ans avec une séroconversion négative survenant après 5 à 10 ans. En conséquence, il est proposé que l'évaluation de l'efficacité pour les études cliniques dans la maladie indéterminée soit effectuée à l'aide de la PCR qualitative et quantitative. Cependant, il y a eu une variabilité significative dans la sensibilité et la spécificité cliniques de la PCR dans les études publiées, avec des différences observées entre les phases de la maladie et un certain nombre de techniques utilisées nécessitant une normalisation. En particulier, on s'est inquiété de la sensibilité de la PCR dans la maladie chronique de Chagas en raison des faibles niveaux de parasites circulants et des fluctuations naturelles de la parasitémie. Les dernières études ont montré une large gamme dynamique pour l'utilisation de la PCR permettant des mesures directes dans les cas à forte charge parasitaire tels que les patients immunodéprimés atteints de la maladie de Chagas et les nouveau-nés infectés congénitalement, ainsi que dans les cas à faible parasitémie, tels que les patients en phase indéterminée ou sous étiologie. traitement. Le test PCR a également été utilisé pour la détection précoce de la réactivation de T. cruzi après une transplantation cardiaque, avec une détection documentée de l'augmentation de la charge parasitaire, avant le diagnostic de la réactivation clinique. En outre, de plus en plus de données cliniques et expérimentales suggèrent un degré de corrélation entre la parasitémie et l'infection des tissus. Une autre avancée importante ces dernières années a été l'étude parrainée par le TDR pour la normalisation et la validation en laboratoire des tests PCR qualitatifs pour T. cruzi. Des procédures standardisées pour l'évaluation qualitative de la PCR (PCR standard et en temps réel) donnant une sensibilité et une spécificité analytiques plus élevées, une reproductibilité, avec de faibles niveaux de variation et de précision intra- et inter-essai ont été sélectionnées. Les résultats de cet exercice ont été présentés lors d'une réunion à Buenos Aires, le 8 novembre, et devraient être publiés prochainement. Cependant, il existe peu d'informations sur l'efficacité du traitement pour les patients atteints de MC chronique indéterminée, et seules quelques études ont utilisé la PCR pour évaluer la réponse parasitologique. Un panel d'experts en CD lors de trois réunions organisées par DNDi et l'équipe de développement du protocole CD ont soutenu l'évaluation de la PCR en tant que marqueur de la réponse parasitologique dans les maladies chroniques indéterminées. Au cours de ces discussions, un consensus s'est dégagé sur l'intérêt d'utiliser des prélèvements sanguins en série pour les tests PCR qualitatifs afin d'augmenter la sensibilité des tests PCR.

Les données à l'appui de cette information se limitent à une cohorte argentine de 41 femmes enceintes suivies par des prélèvements sanguins mensuels. Dans ce petit groupe, la sensibilité de la PCR était de 60,2 % pour un seul prélèvement, 74 % pour 2 prélèvements sanguins et 80,5 % pour 3 prélèvements sanguins (A. Schijman, manuscrit en préparation). De plus, une étude de Castro publiée en 2002 a indiqué une augmentation significative de 70,0% à 81,7% de la sensibilité de la PCR avec l'ajout d'un deuxième échantillon (P = 0,03). L'ajout d'un troisième échantillon a conduit à une augmentation non significative de la sensibilité à 86,7 %. Malheureusement, la taille de l'échantillon était petite, il n'y avait aucune indication de l'intervalle d'échantillonnage et la technique PCR qualitative n'était pas standardisée. Au cours des discussions du panel, il n'y a pas eu d'accord sur l'intervalle précis pour les prélèvements en série, compte tenu du manque d'informations à l'appui d'un intervalle défini pour les prélèvements sanguins afin de maximiser la sensibilité. Les données obtenues avec le xénodiagnostic suggèrent l'absence à la fois du rythme circadien et de la périodicité de T. cruzi chez les individus chagasiques chroniques. Par conséquent, lors de la définition des procédures d'échantillonnage, il faudrait équilibrer le gain sur la sensibilité de la PCR et la logistique/faisabilité dans la conduite d'essais cliniques sur le terrain. Afin de préparer les futurs essais cliniques sur la MC, DNDi reconnaît la nécessité d'évaluer et d'optimiser les procédures de mise en œuvre de la PCR comme outil d'évaluation parasitologique chez les patients atteints de forme chronique indéterminée de la MC. L'approbation éthique de l'étude sera demandée au comité d'examen éthique de Médecins Sans Frontières et au comité d'examen éthique du Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolivie. En outre, l'étude sera soumise et examinée par le Programme national de contrôle de Chagas et le « Comité de Ética e Investigación » del Ministerio de Salud, Bolivie. Il s'agit d'une étude descriptive visant à évaluer si plusieurs procédures d'échantillonnage sanguin par PCR au départ peuvent fournir une sensibilité plus élevée par rapport à un échantillonnage unique, ainsi que leur faisabilité sur le terrain. L'échantillonnage sanguin pour la ligne de base et l'EOT sera le suivant : un échantillon de sang initial de 10 mL (échantillon 1), suivi d'un échantillon de sang de 5 mL prélevé immédiatement après (échantillon 2) ; plus un échantillon de sang de 10 ml prélevé 1 semaine plus tard (échantillon 3). Total de 3 échantillons de sang. Lors des visites de suivi à 6 et 12 mois, seule la stratégie d'échantillonnage optimale à l'EOT sera utilisée.

Stratégies d'échantillonnage :

Afin d'explorer la sensibilité de la PCR en fonction du nombre d'échantillons de sang, les résultats de la PCR seront analysés en tant que tests uniques ainsi que, au stade de l'analyse des données, en combinant les résultats de la PCR pour les patients à un moment donné.

• Référence à utiliser Stratégie actuelle (SC) : Echantillon 1 : Echantillon unique de 10 ml Deux grands types de stratégies peuvent être développées et nécessitent une évaluation :
• Stratégie de renforcement (RS) qui consiste à ajouter des prélèvements sanguins à l'approche actuelle à prélèvement unique (volume de 10 ml). À moins que des prélèvements supplémentaires ne permettent pas de détecter d'autres cas positifs à la PCR (ce qui est peu probable), une telle stratégie sera inévitablement plus sensible que la stratégie actuelle.
• Stratégie de substitution (SS) qui consiste à remplacer l'approche actuelle (échantillon 1 = 10 ml) par un échantillonnage de 5 ml (échantillon 2) et éventuellement d'autres échantillonnages (échantillon 3). Ces stratégies ne sont pas nécessairement meilleures que la stratégie actuelle.

Site d'étude:

La présente étude sera menée dans les communautés rurales des municipalités d'Aiquile, Omereque et Pasorapa dans la province de Narciso Campero, en Bolivie, où Médecins Sans Frontières a mis en place un programme de « prévention, diagnostic et traitement de la maladie de Chagas » en partenariat avec les autorités sanitaires. La population locale est d'environ 40 000 personnes, vivant dans l'une des régions les plus touchées par la MC dans le pays. Dans le cadre de ce programme, les personnes vivant dans les communautés rurales seront dépistées pour la maladie de Chagas et celles qui remplissent les conditions requises seront invitées à participer à l'étude. L'égalité des chances pour le traitement et la gestion de la maladie sera offerte par MSF et ses partenaires à tous les sujets Chagas positifs, qu'ils participent ou non à l'étude.

Critères d'entrée principaux :

Inclusion / Exclusion Patients atteints de MC chronique qui ont l'indication d'un traitement par benznidazole. Les patients doivent remplir les critères d'éligibilité suivants pour l'inscription à l'étude :

Critère d'intégration:

• Âge entre > 18 et 60 ans
• Diagnostic de l'infection à T. cruzi par la sérologie de Chagas. Deux tests sérologiques sur trois doivent être positifs (ELISA conventionnel, ELISA recombinant ou HAI)
• Formulaire de consentement éclairé écrit

Critère d'exclusion:

• Femmes en âge de procréer qui ont un test de grossesse positif lors du dépistage ou qui allaitent Remarque : Les femmes en âge de procréer doivent accepter d'utiliser une méthode contraceptive pendant toute la phase de traitement de l'essai
• Présentation actuelle d'un état de santé grave tel que : tuberculose pulmonaire active et signes cliniques d'insuffisance hépatique ou rénale.
• Cardiomyopathie de Chagas stade II, III et IV (selon la classification NYHA)
• Sujets nécessitant l'implantation d'un stimulateur cardiaque ou d'autres troubles graves de la conduction cardiaque
• Antécédents de traitement de la MC avec du benznidazole ou du nifurtimox à tout moment dans le passé
• Incapacité à se conformer au suivi et/ou ne pas avoir d'adresse permanente
• Antécédents d'abus d'alcool ou de toute autre dépendance à la drogue Ce traitement est conforme aux recommandations locales du Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. La participation du patient à cette étude est volontaire et son refus ou retrait de consentement à tout moment au cours de l'étude n'affectera pas son droit à recevoir un traitement pour la maladie de Chagas.