PCR-tekniikan optimointi kroonista Chagas-tautia sairastavien potilaiden parasitologisen vasteen arvioimiseksi (PCR)

Chagasin tauti (CD) kuuluu maailman laiminlyötyimpiin sairauksiin. Latinalaisessa Amerikassa 21 maassa on endeeminen CD, ja arviolta 108 miljoonalla ihmisellä on riski saada tauti. Arviot 1980-luvulta osoittivat, että noin 16-18 miljoonaa ihmistä sai tartunnan. 1990-luvulla useiden monikansallisten valvontaaloitteiden jälkeen arvioita tartunnan saaneiden ihmisten määrästä tarkistettiin 9,8 miljoonaan vuonna 2001. Arvioitu sairaustaakka vammaisuuteen perustuvina elinvuosina (DALY) laski 2,7 miljoonasta vuonna 1990 586 000:een vuonna 2001. Pan-American Health Organizationin (PAHO) tuoreet arviot vuonna 2006 osoittavat 7,54 miljoonaa tartunnan saanutta ja 55 185 uutta tapausta vuodessa. CD, joka tunnetaan myös nimellä amerikkalainen trypanosomiaasi, on zoonoottinen sairaus, jonka aiheuttaa alkueläinten hemoflagellaatti Trypanosoma cruzi, joka leviää pääasiassa Triatominae-alaheimoon kuuluvien suurten, verta imevien, punasoluisten bakteerien välityksellä. Kliinisesti ihmisen CD:llä on kaksi vaihetta, akuutti ja krooninen. Akuutti, muutaman viikon kestävä vaihe on kuumeinen ja myrkyllinen sairaus, jonka aikana loinen voidaan havaita suoraan tuoreesta verestä. Kroonisessa vaiheessa diagnoosi riippuu vaihtelevan herkkyysasteista hemokulttuureista, ksenodiagnoosista, PCR:stä tai IgG-vasta-aineiden havaitsemisesta. Hoitamattomana krooninen vaihe jatkuu koko loppuelämän. Se alkaa ilman erityisiä oireita tai kliinisiä ilmenemismuotoja noin 10 tai 15 vuoden ajan, taudin "määräämätön muoto". Noin 20–50 % kroonisista Chagas-potilaista seuraavien vuosien aikana, riippuen analysoidusta endeemisestä alueesta, kehittää sydämen tai maha-suolikanavan osallistumista. Nykyinen CD:n hoito rajoittuu kahteen nitroheterosykliseen lääkkeeseen, Nifurtimoxiin ja Benznidatsoliin, joista jälkimmäinen on laajimmin käytetty lääke Chagasin taudin hoidossa. Hoidon indikaatioita ovat akuutti sairaus (mukaan lukien synnynnäinen infektio) ja varhainen krooninen sairaus (eli alle 15-vuotiailla lapsilla ja kroonisen infektion alkuvaiheessa olevilla potilailla) sekä infektion uudelleenaktivointi immunosuppressiolla.

Myöhäinen krooninen vaihe hoidetaan kliinikon harkinnan mukaan. Tarvehierarkiassa on väitetty, että taudin määrittelemättömässä vaiheessa olevat potilaat edustaisivat uusien hoitojen arvioinnin pääkohderyhmää. Sairauden ilmaantuvuuden vähenemisen myötä, jopa niissä maissa, joissa uusien tapausten määrä on eniten, suurin sairaustaakka on potilailla, jotka ovat taudin oireettoman kroonisessa vaiheessa. Esimerkiksi Boliviassa on vähintään 200 000 alle 15-vuotiasta lasta ja miljoona aikuista, jotka ovat saaneet T. cruzi -tartunnan, eli yhteensä arviolta 700 000 ihmistä, joilla on määrittelemätön muoto tai oireeton, krooninen vaihe. Tehokkaan ja kohtuuhintaisen hoidon kehittäminen miljoonille ihmisille, joilla on jatkuva infektio, ja kroonisten komplikaatioiden ehkäisy on tunnustettu keskeiseksi taudinhallinnan painopisteeksi CD:ssä. Parantumisen arviointia pidetään CD:n hoidon monimutkaisimpana osa-alueena, mikä johtaa usein erilaisiin ja kiistanalaisiin tuloksiin. Termi parasitologinen hoito on vaikeasti tulkittava ja arviointi haastava, kun otetaan huomioon tarve eliminoida loiset täydellisesti paitsi verestä myös kudoksesta. Kliininen hoito vaatii pitkän aikavälin arviointia ja on usein luonteeltaan epävarmaa johtuen taudin patogeneesistä, loisen vaikutuksesta, isännän vasteesta ja niistä aiheutuvista kliinisistä ilmenemismuodoista, jotka kehittyvät pitkiä aikoja. Viime vuosina yhä useammat tiedot ovat osoittaneet, että parasitologisten tulosten käytölle akuutin ja määrittelemättömän Chagasin taudin korvikemarkkereina on vahva biologinen peruste. On olemassa yhä enemmän todisteita T. cruzin pysyvyyden roolista immuunivasteen jatkumisessa ja taudin kehittymisessä. Myös viimeaikaiset ei-satunnaistetut kliiniset tutkimukset, joissa on pitkäaikainen seuranta, ovat osoittaneet loisten vastaisen kemoterapian positiivisen vaikutuksen kroonista CD:tä sairastavilla potilailla ja näiden löydösten korrelaation serologisten tulosten kanssa. Siksi kliinisen kehityksen ja konseptin todistamisen tarkoituksiin on ehdotettu, että parasitologisia ja serologisia testejä käytetään vasteen arvioimiseen sekä akuuteissa että kroonisissa sairauksissa. Negatiivinen suora sivelynäyte hoidon lopussa hyväksytään yleisesti todisteeksi vasteesta akuuteilla potilailla. Kroonisissa sairauksissa serologisen arvioinnin tukena voidaan käyttää sarja hemokulttuuria, ksenodiagnoosia tai PCR:ää ja positiivinen parasitologinen tulos viittaa hoidon epäonnistumiseen. Hemokulttuuri ja ksenodiagnoosi ovat tekniikoita, jotka voivat aiheuttaa alhaista herkkyyttä kroonisilla potilailla, ne vaativat asianmukaisia ​​resursseja/infrastruktuuria ja erittäin ammattitaitoista henkilökuntaa. Mitä tulee tavanomaiseen serologiaan, epämääräisillä kroonisilla potilailla vasta-ainetiitterien lasku voi kestää jopa 5 vuotta serokonversion ollessa negatiivinen 5-10 vuoden kuluttua. Tästä syystä ehdotetaan, että määrittämättömän sairauden kliinisissä tutkimuksissa tehokkuuden arviointi tehdään käyttämällä kvalitatiivista ja kvantitatiivista PCR:ää. Julkaistuissa tutkimuksissa PCR:n kliinisessä herkkyydessä ja spesifisyydessä on kuitenkin ollut merkittävää vaihtelua, ja eroja on havaittu taudin eri vaiheissa ja useissa käytössä olevissa tekniikoissa, jotka vaativat standardointia. Erityisesti on ollut huolta PCR:n herkkyydestä kroonisessa Chagasin taudissa, mikä johtuu kiertävien loisten alhaisista tasoista ja parasitemian luonnollisista vaihteluista. Viimeisimmät tutkimukset ovat osoittaneet laajan dynaamisen alueen PCR-käytölle, mikä mahdollistaa suorien mittausten tapauksissa, joissa on suuri loiskuormitus, kuten immunosuppressoituneet Chagas-tautipotilaat ja synnynnäisesti infektoituneet vastasyntyneet, sekä tapauksissa, joissa parasitemioita on vähän, kuten epämääräisessä vaiheessa tai etiologisissa olosuhteissa. hoitoon. PCR-testausta on myös käytetty T. cruzi -reaktivaation varhaiseen havaitsemiseen sydämensiirron jälkeen, ja loiskuormituksen kasvu on dokumentoitu havaittu ennen kliinisen reaktivaation diagnosointia. Lisäksi kertyy kliinisiä ja kokeellisia tietoja, jotka viittaavat tiettyyn korrelaatioon parasitemian ja kudosinfektion välillä. Toinen tärkeä edistysaskel viime vuosina on ollut TDR:n rahoittama tutkimus T. cruzin kvalitatiivisten PCR-testien standardoimiseksi ja laboratoriovalidoimiseksi. PCR:n kvalitatiiviseen arviointiin (standardi ja reaaliaikainen PCR) on valittu standardoidut menetelmät, jotka tuottavat korkeamman analyyttisen herkkyyden ja spesifisyyden, toistettavuuden sekä alhaiset sisäiset ja sisäiset vaihtelut ja tarkkuudet. Tämän harjoituksen tulokset on esitelty kokouksessa Buenos Airesissa 8. marraskuuta, ja niiden odotetaan julkaistavan lähitulevaisuudessa. Kroonisten epämääräisten CD-potilaiden hoidon tehokkuudesta on kuitenkin vain vähän tietoa, ja vain muutamassa tutkimuksessa käytettiin PCR:ää parasitologisen vasteen arvioimiseen. CD:n asiantuntijapaneeli kolmessa DNDi:n ja CD-protokollan kehittämisryhmän isännöimässä kokouksessa tuki PCR:n arviointia parasitologisen vasteen markkerina määrittelemättömässä kroonisessa sairaudessa. Näiden keskustelujen aikana vallitsi yhteisymmärrys siitä, kuinka arvokasta on käyttää sarjaverinäytteet kvalitatiivisiin PCR-määrityksiin PCR-testauksen herkkyyden lisäämiseksi.

Tätä tietoa tukevat tiedot rajoittuvat Argentiinan kohorttiin, jossa on 41 raskaana olevaa naista, joita seurataan kuukausittain otetuilla verenkeräyksillä. Tässä pienessä ryhmässä PCR-herkkyys oli 60,2 % yhdellä näytteellä, 74 % kahdella verinäytteellä ja 80,5 % 3 verinäytteellä (A. Schijman, käsikirjoitus valmisteilla). Lisäksi vuonna 2002 julkaistu Castron tutkimus osoitti, että PCR:n herkkyys lisääntyi merkittävästi 70,0 %:sta 81,7 %:iin, kun toinen näyte lisättiin (P=0,03). Kolmannen näytteen lisääminen johti ei-merkitsevään herkkyyden nousuun 86,7 prosenttiin. Valitettavasti näytekoko oli pieni, näytteenottovälistä ei ollut viitteitä ja kvalitatiivinen PCR-tekniikka oli standardoimaton. Paneelikeskustelujen aikana ei päästy yhteisymmärrykseen sarjanäytteenottovälistä, koska ei ollut tietoa, joka tukisi tiettyä verinäytteenottoväliä herkkyyden maksimoimiseksi. Ksenodiagnoosilla saadut tiedot viittaavat sekä vuorokausirytmin että T. cruzi -jaksollisuuden puuttumiseen kroonisilla chagasilla yksilöillä. Siksi näytteenottomenetelmiä määriteltäessä olisi tasapainotettava PCR-herkkyyden ja logistiikan/toteutettavuuden hyöty suoritettaessa kliinisiä tutkimuksia kenttäolosuhteissa. Valmistautuakseen tuleviin CD:n kliinisiin tutkimuksiin DNDi tunnustaa tarpeen arvioida ja optimoida PCR:n toteuttamismenettelyt parasitologisen arvioinnin välineenä potilailla, joilla on krooninen määrittelemätön CD. Tutkimuksen eettistä hyväksyntää haetaan Médecins Sans Frontières Ethical Review Boardilta ja eettiseltä arviointilautakunnalta Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Socialista (CEADES), Cochabamba, Bolivia. Lisäksi National Chagas Control Program ja "Comité de Ética e Investigación" del Ministerio de Salud, Bolivia toimittaa tutkimuksen ja arvioivat sen. Tämä on kuvaava tutkimus, jonka tarkoituksena on arvioida, voivatko useat PCR-verinäytteiden otot lähtötilanteessa tarjota suuremman herkkyyden kuin yksittäinen näytteenotto, sekä niiden toteutettavuutta kenttäolosuhteissa. Verinäyte lähtötilanteen ja EOT:n osalta on seuraava: yksi ensimmäinen 10 ml:n verinäyte (näyte 1), jota seuraa 1 5 ml:n verinäyte, joka otetaan välittömästi sen jälkeen (näyte 2); plus yksi 10 ml:n verinäyte, joka kerättiin 1 viikkoa myöhemmin (näyte 3). Yhteensä 3 verinäytettä. 6 ja 12 kuukauden seurantakäynneillä käytetään vain optimaalista näytteenottostrategiaa EOT:ssa.

Näytteenottostrategiat:

PCR-herkkyyden selvittämiseksi verinäytteiden lukumäärän mukaan PCR-tulokset analysoidaan yksittäisinä määrityksinä sekä data-analyysivaiheessa yhdistelemällä potilaiden PCR-tuloksia tiettynä ajankohtana.

• Käytettävä viite Nykyinen strategia (CS): Näyte 1: Yksittäinen 10 ml:n näyte Voidaan kehittää kahdentyyppisiä strategioita, jotka vaativat arvioinnin:
• Vahvistusstrategia (RS), joka koostuu verinäytteiden lisäämisestä nykyiseen yhden näytteen menetelmään (tilavuus 10 ml). Elleivät lisänäytteenotolla ole mahdollista havaita uusia PCR-positiivisia tapauksia (mikä on epätodennäköistä), tällainen strategia on väistämättä herkempi kuin nykyinen.
• Korvausstrategia (SS), jossa nykyinen lähestymistapa (näyte 1 = 10 ml) korvataan 5 ml:n näytteenotolla (näyte 2) ja mahdollisesti lisänäytteenotolla (näyte 3). Nämä strategiat eivät välttämättä ole nykyistä parempia.

Tutkimussivusto:

Tämä tutkimus suoritetaan maaseutuyhteisöissä Aiquilen, Omerequen ja Pasorapan kunnissa Narciso Camperon maakunnassa Boliviassa, missä Lääkärit ilman rajoja on perustanut ohjelman "Chagasin taudin ehkäisyä, diagnosointia ja hoitoa" yhteistyössä paikallisten kanssa. terveysviranomaiset. Paikallinen väestö on noin 40 000 yksilöä, jotka asuvat yhdellä maan eniten CD-taudin esiintyvyydestä kärsivillä alueilla. Tämän ohjelman yhteydessä maaseutuyhteisöissä asuvat henkilöt seulotaan Chagasin taudin varalta ja kelpoisuuden täyttäneet kutsutaan osallistumaan tutkimukseen. MSF ja sen kumppanit tarjoavat yhtäläiset mahdollisuudet sairauden hoitoon ja hallintaan kaikille Chagas-positiivisille koehenkilöille riippumatta osallistumisesta tutkimukseen tai ei.

Pääkriteerit pääsyyn:

Inkluusio / poissulkeminen Potilaat, joilla on krooninen CD-sairaus ja joilla on käyttöaihe bentsnidatsolihoitoon. Potilaiden on täytettävä seuraavat kelpoisuusvaatimukset tutkimukseen ilmoittautumiseksi:

Sisällyttämiskriteerit:

• Ikä yli 18-60 vuotta
• T. cruzi -infektion diagnoosi Chagasin serologialla. Kahden kolmesta serologisesta testistä on oltava positiivinen (tavallinen ELISA, rekombinantti ELISA tai HAI)
• Kirjallinen tietoinen suostumuslomake

Poissulkemiskriteerit:

• Lisääntymisiässä olevat naiset, joilla on positiivinen raskaustesti seulonnassa tai jotka imettävät Huomautus: Lisääntymisiässä olevien naisten tulee hyväksyä ehkäisymenetelmän käyttö koko kokeen hoitovaiheen ajan
• Tämänhetkinen esitys vakavasta terveydentilasta, kuten: aktiivinen keuhkotuberkuloosi ja maksan tai munuaisten vajaatoiminnan kliiniset oireet.
• Chagasin kardiomyopatian vaiheet II, III ja IV (NYHA-luokituksen mukaan)
• Potilaat, jotka tarvitsevat sydämentahdistimen istutusta tai muita vakavia sydämen johtumishäiriöitä
• Aiempi CD-hoito bentsnidatsolilla tai nifurtimoxilla milloin tahansa aiemmin
• Kyvyttömyys noudattaa seurantaa ja/tai ilman pysyvää osoitetta
• Alkoholin väärinkäytön tai muun huumeriippuvuuden historia Huomautus: kaikkia tähän tutkimukseen osallistuvia potilaita hoidetaan bentnidatsolilla, 5 mg/kg/vrk PO BID 60 päivän ajan MSF:n Aiquilen maaseutuyhteisöissä tarjoaman rutiinihoidon mukaisesti. Tämä hoito on Ministerio de Salud y Deportes de Bolivian paikallisten suositusten mukainen. Potilaan osallistuminen tähän tutkimukseen on vapaaehtoista, eikä hänen suostumuksensa kieltäytyminen tai peruuttaminen milloin tahansa tutkimuksen aikana vaikuta hänen oikeuteensa saada hoitoa Chagasin taudin vuoksi.