Optimización de Técnica PCR para Evaluar Respuesta Parasitológica en Pacientes con Enfermedad de Chagas Crónica (PCR)

La enfermedad de Chagas (EC) se encuentra entre las enfermedades más desatendidas del mundo. En América Latina, 21 países son endémicos para EC con un estimado de 108 millones de personas en riesgo de contraer la enfermedad. Las estimaciones de la década de 1980 indicaron que entre 16 y 18 millones de personas estaban infectadas. En la década de 1990, luego de una serie de iniciativas multinacionales de control, las estimaciones del número de personas infectadas se revisaron a 9,8 millones en 2001. La carga estimada de enfermedad en términos de años de vida ajustados por discapacidad (AVAD) disminuyó de 2,7 millones en 1990 a 586.000 en 2001. Estimaciones recientes de la Organización Panamericana de la Salud (OPS), 2006 indican 7,54 millones de personas infectadas y 55.185 casos nuevos por año. La EC, también conocida como tripanosomiasis americana, es una enfermedad zoonótica causada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi que se transmite principalmente por insectos redúvidos grandes, hematófagos, de la subfamilia Triatominae. Clínicamente, la EC humana tiene dos fases, aguda y crónica. La fase aguda, que dura unas pocas semanas, es una enfermedad febril y toxémica, durante la cual el parásito puede detectarse mediante examen directo de sangre fresca. En la fase crónica, el diagnóstico depende de hemocultivos de diferente grado de sensibilidad, xenodiagnóstico, PCR o detección de anticuerpos IgG. Sin tratamiento, la fase crónica continúa por el resto de la vida de una persona. Comienza sin síntomas específicos ni manifestaciones clínicas por un período de aproximadamente 10 o 15 años, la "forma indeterminada" de la enfermedad. Alrededor del 20 al 50% de los pacientes crónicos de Chagas en los años siguientes, según el área endémica analizada, desarrollarán compromiso del corazón o del tracto gastrointestinal. La terapia actual para la EC se limita a dos fármacos nitroheterocíclicos, Nifurtimox y Benznidazol, siendo este último el fármaco más utilizado para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Las indicaciones de tratamiento son la enfermedad aguda (incluida la infección congénita) y la enfermedad crónica precoz (es decir, en niños < 15 años y pacientes en la fase inicial de la infección crónica), más la reactivación de la infección por inmunosupresión.

La fase crónica tardía se trata a discreción del médico. En una jerarquía de necesidades, se ha argumentado que los pacientes en la fase indeterminada de la enfermedad representarían la principal población diana para la evaluación de nuevos tratamientos. Con una incidencia decreciente de la enfermedad, incluso en países con el mayor número de casos nuevos, la mayor carga de enfermedad se encuentra entre los pacientes en la fase crónica asintomática de la enfermedad. Bolivia, por ejemplo, tiene al menos 200.000 niños menores de 15 años y 1 millón de adultos infectados con T. cruzi, para un total estimado de 700.000 personas con la forma indeterminada o asintomática, fase crónica. El desarrollo de un tratamiento eficaz y asequible para los millones de personas con infecciones en curso y la prevención de complicaciones crónicas se reconoce como una prioridad clave para el control de enfermedades en la EC. La evaluación de la curación se considera el aspecto más complejo del tratamiento de la EC, lo que a menudo conduce a resultados diversos y controvertidos. El término cura parasitológica es de difícil interpretación y desafiante la evaluación, ante la necesidad de la eliminación total de los parásitos no sólo de la sangre sino también de los tejidos. La curación clínica exige una evaluación a largo plazo y, a menudo, es de naturaleza incierta debido a la patogénesis de la enfermedad, con la acción del parásito, la respuesta del huésped y sus consecuentes manifestaciones clínicas evolucionando durante largos períodos de tiempo. En los últimos años, un creciente cuerpo de datos ha señalado una fuerte justificación biológica para el uso de resultados parasitológicos como marcadores sustitutos de la enfermedad de Chagas aguda e indeterminada. Cada vez hay más pruebas del papel de la persistencia de T. cruzi en la perpetuación de la respuesta inmune y la evolución de la enfermedad. Además, recientes ensayos clínicos no aleatorizados con seguimiento a largo plazo han demostrado un efecto positivo de la quimioterapia antiparasitaria en pacientes con EC crónica y la correlación de estos hallazgos con los resultados de la serología. Por lo tanto, a los efectos del desarrollo clínico y la prueba de concepto, se ha sugerido que se utilicen pruebas parasitológicas y serológicas para evaluar la respuesta en enfermedades tanto agudas como crónicas. Un frotis directo negativo al final del tratamiento generalmente se acepta como evidencia de respuesta en pacientes agudos. En enfermedades crónicas, el hemocultivo en serie, el xenodiagnóstico o la PCR se pueden utilizar para respaldar la evaluación serológica y un resultado parasitológico positivo indica un fracaso del tratamiento. El hemocultivo y el xenodiagnóstico son técnicas que pueden presentar baja sensibilidad en pacientes crónicos, requieren recursos/infraestructura adecuados y personal muy capacitado. Con respecto a la serología convencional, en pacientes crónicos indeterminados, la disminución de los títulos de anticuerpos puede demorar hasta 5 años y la seroconversión a negatividad ocurre después de 5 a 10 años. En consecuencia, se propone que la evaluación de la eficacia para estudios clínicos en enfermedad indeterminada se realice con el uso de PCR cualitativa y cuantitativa. Sin embargo, ha habido una variabilidad significativa en la sensibilidad y especificidad clínicas de la PCR en los estudios publicados, con diferencias observadas entre las fases de la enfermedad y varias técnicas en uso que requieren estandarización. En particular, ha habido preocupación con respecto a la sensibilidad de la PCR en la enfermedad de Chagas crónica debido a los bajos niveles de parásitos circulantes y las fluctuaciones naturales de la parasitemia. Los últimos estudios han demostrado un amplio rango dinámico para el uso de PCR que permite mediciones directas en casos con altas cargas parasitarias, como pacientes con enfermedad de Chagas inmunodeprimidos y recién nacidos con infección congénita, así como en casos con parasitemias bajas, como pacientes en fase indeterminada o bajo etiológico. tratamiento. La prueba de PCR también se ha utilizado para la detección temprana de la reactivación de T. cruzi después del trasplante de corazón, con detección documentada de aumento de la carga parasitaria, previo al diagnóstico de reactivación clínica. Además, se están acumulando datos clínicos y experimentales que sugieren un grado de correlación entre la parasitemia y la infección tisular. Otro avance importante en los últimos años ha sido el estudio patrocinado por el TDR para la estandarización y validación en laboratorio de las pruebas PCR cualitativas para T. cruzi. Se han seleccionado procedimientos estandarizados para la evaluación cualitativa de la PCR (PCR estándar y en tiempo real) que producen una mayor sensibilidad y especificidad analíticas, reproducibilidad, con bajos niveles de variación y precisión intraensayo e interensayo. Los resultados de este ejercicio se presentaron en una reunión en Buenos Aires, el 8 de noviembre, y se espera que se publiquen en un futuro próximo. Sin embargo, existe información limitada sobre la eficacia del tratamiento para pacientes con EC crónica indeterminada, y solo unos pocos estudios emplearon PCR para evaluar la respuesta parasitológica. Un panel de expertos en EC en tres reuniones organizadas por la DNDi y el equipo de desarrollo del protocolo de EC dieron apoyo a la evaluación de la PCR como marcador de respuesta parasitológica en enfermedades crónicas indeterminadas. Durante estas discusiones, hubo consenso sobre el valor de usar muestras de sangre en serie para ensayos de PCR cualitativos con el fin de aumentar la sensibilidad de las pruebas de PCR.

Los datos que respaldan esta información se limitan a una cohorte argentina de 41 mujeres embarazadas seguidas con muestras de sangre mensuales. En este pequeño grupo, la sensibilidad de la PCR fue del 60,2 % para una sola extracción, del 74 % para 2 extracciones de sangre y del 80,5 % para 3 extracciones de sangre (A. Schijman, manuscrito en preparación). Además, un estudio de Castro publicado en 2002 indicó un aumento significativo del 70,0 % al 81,7 % en la sensibilidad de la PCR con la adición de una segunda muestra (P=0,03). La adición de una tercera muestra condujo a un aumento no significativo de la sensibilidad al 86,7 %. Desafortunadamente, el tamaño de la muestra era pequeño, no había indicación del intervalo de muestreo y la técnica de PCR cualitativa no estaba estandarizada. Durante las discusiones del panel, no hubo acuerdo sobre el intervalo preciso para el muestreo en serie, en vista de la falta de información que respalde un intervalo definido para el muestreo de sangre para maximizar la sensibilidad. Los datos obtenidos con xenodiagnóstico sugieren la ausencia tanto del ritmo circadiano como de la periodicidad de T. cruzi en individuos chagásicos crónicos. Por lo tanto, al definir los procedimientos de muestreo, sería necesario equilibrar la ganancia en la sensibilidad de la PCR y la logística/factibilidad en la realización de ensayos clínicos en un entorno de campo. Con el fin de prepararse para futuros ensayos clínicos en EC, la DNDi reconoce la necesidad de evaluar y optimizar los procedimientos para la implementación de PCR como herramienta de evaluación parasitológica en pacientes con EC crónica indeterminada. Se buscará la aprobación ética del estudio de la Junta de Revisión Ética de Médicos Sin Fronteras y la Junta de Revisión Ética del Colectivo de Estudios Aplicados y Desarrollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolivia. Además, el estudio será presentado y revisado por el Programa Nacional de Control de Chagas y el 'Comité de Ética e Investigación' del Ministerio de Salud, Bolivia. Este es un estudio descriptivo que tiene como objetivo evaluar si múltiples procedimientos de muestreo de sangre por PCR al inicio pueden proporcionar una mayor sensibilidad en comparación con el muestreo único, así como su viabilidad en un entorno de campo. El muestreo de sangre para la línea de base y el EOT será el siguiente: una muestra de sangre inicial de 10 mL (Muestra 1), seguida de 1 muestra de sangre de 5 mL recolectada inmediatamente después (Muestra 2); más una muestra de sangre de 10 mL recogida 1 semana después (Muestra 3). Total de 3 muestras de sangre. En las visitas de seguimiento a los 6 y 12 meses, solo se utilizará la estrategia de muestreo óptima en el EOT.

Estrategias de muestreo:

Para explorar la sensibilidad de la PCR según el número de muestras de sangre, los resultados de la PCR se analizarán como ensayos únicos y, en la etapa de análisis de datos, mediante la combinación de los resultados de la PCR de los pacientes en un punto de tiempo determinado.

• Referencia a utilizar Estrategia actual (CS): Muestra 1: Muestra única de 10 ml Se pueden desarrollar dos tipos principales de estrategias y necesitan una evaluación:
• Estrategia de refuerzo (ER) que consiste en agregar muestras de sangre al enfoque actual de muestra única (volumen de 10 ml). A menos que los muestreos adicionales no permitan la detección de más casos positivos por PCR (lo que es poco probable), dicha estrategia será inevitablemente más sensible que la actual.
• Estrategia de sustitución (SS) que consiste en reemplazar el enfoque actual (muestra 1 = 10 ml) por un muestreo de 5 ml (muestra 2) y posiblemente más muestreo (s) (muestra 3). Estas estrategias no son necesariamente mejores que la actual.

Sitio de Estudio:

El presente estudio se llevará a cabo en comunidades rurales de los municipios de Aiquile, Omereque y Pasorapa en la provincia de Narciso Campero, Bolivia, donde Médicos Sin Fronteras ha establecido un programa de "prevención, diagnóstico y tratamiento de la enfermedad de Chagas" en alianza con el municipio autoridades sanitarias. La población local es de ~ 40.000 individuos, viviendo en una de las zonas con mayor carga de EC del país. En el contexto de este programa, las personas que viven en comunidades rurales serán tamizadas para la enfermedad de Chagas y aquellos que cumplan con los requisitos serán invitados a participar en el estudio. MSF y sus socios brindarán igualdad de oportunidades para el tratamiento y manejo de la enfermedad a todos los sujetos positivos a Chagas, independientemente de su participación o no en el estudio.

Criterios principales de entrada:

Inclusión / Exclusión Pacientes con EC crónica que tengan indicación de tratamiento con benznidazol. Los pacientes deben cumplir con los siguientes criterios de elegibilidad para la inscripción en el estudio:

Criterios de inclusión:

• Edad entre > 18 - 60 años
• Diagnóstico de infección por T. cruzi por serología de Chagas. Dos de cada tres pruebas serológicas deben ser positivas (ELISA convencional, ELISA recombinante o HAI)
• Formulario de consentimiento informado por escrito

Criterio de exclusión:

• Mujeres en edad reproductiva que tengan una prueba de embarazo positiva en la selección o que estén amamantando Nota: las mujeres en edad reproductiva deben aceptar usar un método anticonceptivo durante toda la fase de tratamiento del ensayo
• Presentación actual de condición de salud grave como: tuberculosis pulmonar activa y signos clínicos de insuficiencia hepática o renal.
• Miocardiopatía chagásica estadios II, III y IV (según la clasificación de la NYHA)
• Sujetos que requieren implantación de marcapasos u otros defectos graves de conducción cardíaca
• Antecedentes de tratamiento de EC con benznidazol o nifurtimox en cualquier momento en el pasado
• Incapacidad para cumplir con el seguimiento y/o no tener una dirección permanente
• Antecedentes de abuso de alcohol o cualquier otra adicción a las drogas Nota: todos los pacientes que participan en este estudio serán tratados con Benznidazol, 5 mg/Kg/día PO BID durante 60 días, según la atención de rutina brindada por MSF en las comunidades rurales de Aiquile. Este tratamiento está de acuerdo con las recomendaciones locales del Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. La participación del paciente en este estudio es voluntaria y su negativa o retiro del consentimiento en cualquier momento durante el estudio no afectará su derecho a recibir tratamiento para la enfermedad de Chagas.