Optimalisatie van PCR-techniek om parasitologische respons te beoordelen voor patiënten met chronische ziekte van Chagas (PCR)

De ziekte van Chagas (CD) behoort tot de meest verwaarloosde ziekten ter wereld. In Latijns-Amerika zijn 21 landen endemisch voor coeliakie, met naar schatting 108 miljoen mensen die het risico lopen de ziekte op te lopen. Schattingen uit de jaren tachtig gaven aan dat zo'n 16-18 miljoen personen besmet waren. In de jaren negentig werden de schattingen van het aantal besmette mensen, na een reeks multinationale controle-initiatieven, herzien tot 9,8 miljoen in 2001. De geschatte ziektelast in termen van voor invaliditeit gecorrigeerde levensjaren (DALY's) daalde van 2,7 miljoen in 1990 tot 586.000 in 2001. Recente schattingen van de Pan-American Health Organization (PAHO), 2006 wijzen op 7,54 miljoen geïnfecteerde mensen en 55.185 nieuwe gevallen per jaar. CD, ook bekend als Amerikaanse trypanosomiasis, is een zoönotische ziekte die wordt veroorzaakt door het protozoaire hemoflagellaat Trypanosoma cruzi en die voornamelijk wordt overgedragen door grote, bloedzuigende, kleine insecten van de onderfamilie Triatominae. Klinisch heeft de ziekte van de mens twee fasen, acuut en chronisch. De acute fase, die enkele weken duurt, is een koortsachtige en toxemische ziekte, waarin de parasiet kan worden opgespoord door direct onderzoek van vers bloed. In de chronische fase hangt de diagnose af van hemoculturen van verschillende mate van gevoeligheid, xenodiagnose, PCR of het detecteren van IgG-antilichamen. Onbehandeld gaat de chronische fase de rest van iemands leven door. Het begint zonder specifieke symptomen of klinische manifestaties gedurende een periode van ongeveer 10 of 15 jaar, de "onbepaalde vorm" van de ziekte. Ongeveer 20 tot 50% van de chronische Chagas-patiënten zal in de daaropvolgende jaren, afhankelijk van het geanalyseerde endemische gebied, betrokkenheid van het hart of het maagdarmkanaal ontwikkelen. De huidige therapie voor coeliakie is beperkt tot twee nitroheterocyclische geneesmiddelen, nifurtimox en benznidazol, waarvan het laatste het meest gebruikte geneesmiddel is voor de behandeling van de ziekte van Chagas. De indicaties voor behandeling zijn acute ziekte (inclusief congenitale infectie) en vroege chronische ziekte (d.w.z. bij kinderen < 15 jaar en patiënten in de vroege fase van chronische infectie), plus reactivering van de infectie door immunosuppressie.

De late chronische fase wordt behandeld naar goeddunken van de clinicus. In een hiërarchie van behoeften is betoogd dat patiënten in de onbepaalde fase van de ziekte de belangrijkste doelgroep zouden vormen voor de evaluatie van nieuwe behandelingen. Met een afnemende incidentie van de ziekte, zelfs in landen met het hoogste aantal nieuwe gevallen, ligt de hoogste ziektelast bij patiënten in de asymptomatische, chronische fase van de ziekte. Bolivia heeft bijvoorbeeld minstens 200.000 kinderen onder de 15 jaar en 1 miljoen volwassenen die besmet zijn met T. cruzi, voor een geschat totaal van 700.000 mensen met de onbepaalde vorm of asymptomatische, chronische fase. De ontwikkeling van een effectieve en betaalbare behandeling voor de miljoenen mensen met aanhoudende infecties en de preventie van chronische complicaties wordt erkend als een belangrijke prioriteit voor ziektebestrijding bij de ziekte van Crohn. De evaluatie van genezing wordt beschouwd als het meest complexe aspect van de behandeling van coeliakie, wat leidt tot vaak uiteenlopende en controversiële resultaten. De term parasitologische genezing is moeilijk te interpreteren en de evaluatie uitdagend, in het licht van de noodzaak van totale eliminatie van parasieten, niet alleen uit bloed maar ook uit weefsel. Klinische genezing vereist evaluatie op lange termijn en is vaak van onzekere aard vanwege de pathogenese van de ziekte, met de werking van de parasiet, de reactie van de gastheer en de daaruit voortvloeiende klinische manifestaties die zich gedurende een lange periode ontwikkelen. De afgelopen jaren heeft een toenemend aantal gegevens gewezen op een sterke biologische grondgedachte voor het gebruik van parasitologische uitkomsten als surrogaatmarkers voor acute en onbepaalde ziekte van Chagas. Er zijn steeds meer aanwijzingen voor de rol van T. cruzi-persistentie bij de voortzetting van de immuunrespons en de evolutie van de ziekte. Ook hebben recente niet-gerandomiseerde klinische onderzoeken met langdurige follow-up een positief effect aangetoond van antiparasitaire chemotherapie bij patiënten met chronische CD en de correlatie van deze bevindingen met serologische resultaten. Daarom is met het oog op klinische ontwikkeling en proof-of-concept voorgesteld om parasitologische en serologische tests te gebruiken voor de beoordeling van de respons bij zowel acute als chronische ziekten. Een negatief direct uitstrijkje aan het einde van de behandeling wordt algemeen aanvaard als bewijs van respons bij acute patiënten. Bij chronische ziekten kan seriële hemocultuur, xenodiagnose of PCR worden gebruikt ter ondersteuning van serologische beoordeling en een positief parasitologisch resultaat duidt op falen van de behandeling. Hemocultuur en xenodiagnose zijn technieken die bij chronische patiënten een lage gevoeligheid kunnen vertonen, ze vereisen de juiste middelen/infrastructuur en zeer bekwaam personeel. Met betrekking tot conventionele serologie, bij onbepaalde chronische patiënten kan een afname van antilichaamtiters tot 5 jaar duren, waarbij seroconversie naar negatief optreedt na 5-10 jaar. Bijgevolg wordt voorgesteld om de werkzaamheidsbeoordeling voor klinische studies bij onbepaalde ziekte uit te voeren met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve PCR. Er is echter een significante variabiliteit in de klinische sensitiviteit en specificiteit van PCR in gepubliceerde onderzoeken, met verschillen tussen verschillende fasen van de ziekte en een aantal gebruikte technieken die standaardisatie vereisen. Er bestaat met name bezorgdheid over de gevoeligheid van PCR bij de chronische ziekte van Chagas vanwege de lage niveaus van circulerende parasieten en natuurlijke fluctuaties van de parasitemie. Recente onderzoeken hebben een breed dynamisch bereik voor PCR-gebruik aangetoond, waardoor directe metingen mogelijk zijn in gevallen met een hoge parasitaire belasting, zoals patiënten met de ziekte van Chagas met immunosuppressie en congenitaal geïnfecteerde pasgeborenen, evenals in gevallen met lage parasitemie, zoals patiënten in de onbepaalde fase of onder etiologische omstandigheden. behandeling. PCR-testen zijn ook gebruikt voor vroege detectie van T. cruzi-reactivering na harttransplantatie, met gedocumenteerde detectie van parasitaire belastingstoename, voorafgaand aan de diagnose van klinische reactivering. Bovendien zijn er steeds meer klinische en experimentele gegevens die wijzen op een zekere correlatie tussen parasitemie en weefselinfectie. Een andere belangrijke vooruitgang in de afgelopen jaren was de door TDR gesponsorde studie voor standaardisatie en laboratoriumvalidatie van kwalitatieve PCR-testen voor T. cruzi. Gestandaardiseerde procedures voor kwalitatieve beoordeling van PCR (standaard en real-time PCR) die hogere analytische gevoeligheid en specificiteit, reproduceerbaarheid opleveren, met lage niveaus van intra- en inter-assay variatie en nauwkeurigheid zijn geselecteerd. De resultaten van deze oefening zijn gepresenteerd tijdens een bijeenkomst in Buenos Aires op 8 november en zullen naar verwachting in de nabije toekomst worden gepubliceerd. Er is echter beperkte informatie over de werkzaamheid van de behandeling van chronisch onbepaalde coeliakiepatiënten, en in slechts enkele onderzoeken werd PCR gebruikt om de parasitologische respons te beoordelen. Een panel van CD-experts tijdens drie bijeenkomsten georganiseerd door DNDi en het CD-protocolontwikkelingsteam ondersteunden de evaluatie van PCR als een marker voor parasitologische respons bij onbepaalde chronische ziekte. Tijdens deze discussies was er consensus over de waarde van het gebruik van seriële bloedafnames voor kwalitatieve PCR-assays om de gevoeligheid van PCR-testen te verhogen.

Gegevens ter ondersteuning van deze informatie zijn beperkt tot een Argentijns cohort van 41 zwangere vrouwen, gevolgd door maandelijkse bloedafnames. In deze kleine groep was de PCR-gevoeligheid 60,2% voor een enkele bloedafname, 74% voor 2 bloedafnames en 80,5% voor 3 bloedafnames (A. Schijman, handschrift in voorbereiding). Bovendien wees een in 2002 gepubliceerde studie van Castro op een significante toename van 70,0% tot 81,7% in de gevoeligheid van PCR met de toevoeging van een tweede monster (P=0,03). De toevoeging van een derde monster leidde tot een niet-significante toename van de gevoeligheid tot 86,7%. Helaas was de steekproefomvang klein, was er geen indicatie van het bemonsteringsinterval en was de kwalitatieve PCR-techniek niet gestandaardiseerd. Tijdens de paneldiscussies was er geen overeenstemming over het precieze interval voor seriële bemonstering, gezien het gebrek aan informatie ter ondersteuning van een definitief interval voor bloedafname om de gevoeligheid te maximaliseren. Gegevens verkregen met xenodiagnose suggereren de afwezigheid van zowel het circadiane ritme als de T. cruzi-periodiciteit bij chronische chagasische individuen. Daarom zou men bij het definiëren van bemonsteringsprocedures een evenwicht moeten vinden tussen de winst op de PCR-gevoeligheid en logistiek/haalbaarheid bij het uitvoeren van klinische proeven in een veldomgeving. Om zich voor te bereiden op toekomstige klinische onderzoeken naar CD, erkent DNDi de noodzaak om de procedures voor PCR-implementatie te evalueren en te optimaliseren als instrument voor parasitologische beoordeling bij patiënten met een chronische onbepaalde vorm van CD. Studie-ethische goedkeuring zal worden gevraagd aan de Ethical Review Board van Artsen Zonder Grenzen en de Ethical Review Board van de Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolivia. Bovendien zal de studie worden ingediend en beoordeeld door het National Chagas Control Program en het 'Comité de Ética e Investigación' del Ministerio de Salud, Bolivia. Dit is een beschrijvend onderzoek dat tot doel heeft te beoordelen of meerdere PCR-bloedafnameprocedures bij baseline een hogere gevoeligheid kunnen bieden in vergelijking met enkele monsterafname, evenals hun haalbaarheid in een veldomgeving. Bloedafname voor basislijn en EOT is als volgt: één eerste bloedmonster van 10 ml (monster 1), gevolgd door 1 bloedmonster van 5 ml dat direct na (monster 2) wordt afgenomen; plus één bloedmonster van 10 ml dat 1 week later werd afgenomen (monster 3). In totaal 3 bloedmonsters. Bij de follow-upbezoeken na 6 en 12 maanden wordt alleen de optimale bemonsteringsstrategie bij EOT gebruikt.

Bemonsteringsstrategieën:

Om de PCR-gevoeligheid te onderzoeken op basis van het aantal bloedmonsters, zullen de PCR-resultaten worden geanalyseerd als enkele assays en, in de data-analysefase, door PCR-resultaten voor patiënten op een bepaald tijdstip te combineren.

• Te gebruiken referentie Huidige strategie (CS): Monster 1: enkel monster van 10 ml Er kunnen twee hoofdtypen strategieën worden ontwikkeld die moeten worden beoordeeld:
• Versterkingsstrategie (RS) die bestaat uit het toevoegen van bloedafname(s) aan de huidige aanpak met één monster (volume van 10 ml). Tenzij extra bemonstering de detectie van extra PCR-positieve gevallen niet mogelijk maakt (wat onwaarschijnlijk is), zal een dergelijke strategie onvermijdelijk gevoeliger zijn dan de huidige.
• Substitutiestrategie (SS) die bestaat uit het vervangen van de huidige aanpak (monster 1 = 10 ml) door een monstername van 5 ml (monster 2) en eventueel verdere monstername(s) (monster 3). Deze strategieën zijn niet noodzakelijkerwijs beter dan de huidige.

Studiesite:

De huidige studie zal worden uitgevoerd in plattelandsgemeenschappen in de gemeenten Aiquile, Omereque en Pasorapa in de provincie Narciso Campero, Bolivia, waar Artsen Zonder Grenzen een programma heeft opgezet voor "preventie, diagnose en behandeling van de ziekte van Chagas" in samenwerking met de lokale gezondheidsautoriteiten. De lokale bevolking bestaat uit ~ 40.000 personen en woont in een van de gebieden met de hoogste ziektelast van CV in het land. In de context van dit programma zullen de personen die in plattelandsgemeenschappen wonen, worden gescreend op de ziekte van Chagas en degenen die in aanmerking komen, zullen worden uitgenodigd om deel te nemen aan het onderzoek. Artsen zonder Grenzen en haar partners zullen gelijke kansen voor behandeling en beheer van de ziekte bieden aan alle Chagas-positieve proefpersonen, ongeacht deelname aan de studie of niet.

Belangrijkste toegangscriteria:

Inclusie / Exclusie Patiënten met chronische coeliakie die de indicatie hebben voor behandeling met benznidazol. Patiënten moeten voldoen aan de volgende criteria om in aanmerking te komen voor deelname aan het onderzoek:

Inclusiecriteria:

• Leeftijd tussen > 18 - 60 jaar
• Diagnose van T. cruzi-infectie door Chagas-serologie. Twee van de drie serologische tests moeten positief zijn (conventionele ELISA, recombinante ELISA of HAI)
• Schriftelijk geïnformeerd toestemmingsformulier

Uitsluitingscriteria:

• Vrouwen in de vruchtbare leeftijd die een positieve zwangerschapstest hebben bij de screening, of die borstvoeding geven Opmerking: Vrouwen in de vruchtbare leeftijd moeten accepteren dat ze een anticonceptiemethode gebruiken tijdens de gehele behandelingsfase van het onderzoek
• Huidige presentatie van een ernstige gezondheidstoestand zoals: actieve longtuberculose en klinische tekenen van lever- of nierfalen.
• Chagas-cardiomyopathie stadium II, III en IV (volgens de NYHA-classificatie)
• Onderwerpen waarbij een pacemaker moet worden geïmplanteerd of andere ernstige hartgeleidingsstoornissen
• Geschiedenis van CD-behandeling met benznidazol of nifurtimox op enig moment in het verleden
• Niet kunnen voldoen aan opvolging en/of geen vast adres hebben
• Voorgeschiedenis van alcoholmisbruik of een andere drugsverslaving Opmerking: alle patiënten die deelnemen aan deze studie zullen worden behandeld met benznidazol, 5 mg/kg/dag PO BID gedurende 60 dagen, volgens de routinezorg die Artsen zonder Grenzen biedt in plattelandsgemeenschappen in Aiquile. Deze behandeling is in overeenstemming met de lokale aanbevelingen van het Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. De deelname van de patiënt aan dit onderzoek is vrijwillig en zijn weigering of intrekking van toestemming op enig moment tijdens het onderzoek heeft geen invloed op zijn/haar recht op behandeling voor de ziekte van Chagas.