优化 PCR 技术评估慢性南美锥虫病患者的寄生虫反应 (PCR)

南美锥虫病 (CD) 是世界上最容易被忽视的疾病之一。 在拉丁美洲，有 21 个国家流行 CD，估计有 1.08 亿人有感染该病的风险。 1980 年代的估计表明，大约有 16 -18 百万人被感染。 在 1990 年代，经过一系列多国控制措施后，2001 年的感染人数估计被修正为 980 万。 根据伤残调整生命年 (DALY) 估计的疾病负担从 1990 年的 270 万下降到 2001 年的 586,000。 2006 年泛美卫生组织 (PAHO) 的最新估计表明每年有 754 万感染者和 55,185 例新病例。 CD，也称为美洲锥虫病，是由原生动物血鞭毛虫克氏锥虫引起的人畜共患疾病，主要通过锥虫亚科的大型吸血吸虫科昆虫传播。 临床上，人类CD有两个阶段，急性和慢性。 持续数周的急性期是一种发热和毒血症，在此期间可以通过直接检查新鲜血液来检测寄生虫。 在慢性期，诊断依赖于不同程度敏感性的血培养、异种诊断、PCR或检测IgG抗体。 未经治疗，慢性期会持续一个人的余生。 它开始时没有特定症状或临床表现，持续大约 10 或 15 年，是该疾病的“不确定形式”。 在接下来的几年中，大约 20% 到 50% 的慢性南美锥虫病患者（取决于所分析的流行区域）将发展为心脏或胃肠道受累。 目前对 CD 的治疗仅限于两种硝基杂环类药物，硝呋替莫和苄硝唑，后者是南美锥虫病治疗中使用最广泛的药物。 治疗适应症是急性疾病（包括先天性感染）和早期慢性疾病（即小于 15 岁的儿童和处于慢性感染早期阶段的患者），加上免疫抑制引起的感染再激活。

晚期慢性期的治疗由临床医生决定。 在需求层次结构中，有人认为处于疾病不确定阶段的患者将代表评估新疗法的主要目标人群。 随着该病发病率的下降，即使在新发病例数最多的国家，无症状慢性期患者的疾病负担也最重。 例如，玻利维亚至少有 200,000 名 15 岁以下儿童和 100 万成年人感染了克氏锥虫，估计共有 700,000 人处于不确定形式或无症状的慢性期。 为数百万持续感染的人开发有效且负担得起的治疗方法并预防慢性并发症被认为是 CD 的关键疾病控制优先事项。 治愈评估被认为是 CD 治疗中最复杂的方面，通常会导致多种多样且有争议的结果。 鉴于不仅需要从血液中而且从组织中完全消除寄生虫，寄生虫学治愈这个术语很难解释并且评估具有挑战性。 临床治愈需要长期评估，并且由于疾病的发病机制，寄生虫的作用，宿主反应及其随后的临床表现在很长一段时间内不断演变，因此往往具有不确定性。 近年来，越来越多的数据表明，使用寄生虫学结果作为急性和不确定的南美锥虫病的替代标志物有很强的生物学依据。 越来越多的证据表明克氏锥虫在免疫反应的持续存在和疾病的演变中的持续作用。 此外，最近的长期随访非随机临床试验已经证明抗寄生虫化疗对慢性 CD 患者有积极作用，以及这些发现与血清学结果的相关性。 因此，出于临床开发和概念验证的目的，建议使用寄生虫学和血清学测试来评估急性和慢性疾病的反应。 治疗结束时的阴性直接涂片通常被认为是急性患者反应的证据。 在慢性病中，系列血培养、异种诊断或 PCR 可用于支持血清学评估，阳性寄生虫学结果表明治疗失败。 血液培养和异种诊断是对慢性病患者敏感性较低的技术，它们需要适当的资源/基础设施和非常熟练的人员。 关于常规血清学，对于不确定的慢性患者，抗体滴度的降低可能需要长达 5 年的时间，5-10 年后发生血清转阴。 因此，建议使用定性和定量 PCR 对不确定疾病的临床研究进行疗效评估。 然而，在已发表的研究中，PCR 的临床敏感性和特异性存在显着差异，在疾病的不同阶段和使用中的许多技术都需要标准化。 特别是，由于循环寄生虫水平低和寄生虫血症的自然波动，人们一直担心 PCR 在慢性南美锥虫病中的敏感性。 最新研究表明，PCR 的使用具有广泛的动态范围，允许在寄生虫负荷高的情况下直接测量，例如免疫抑制的南美锥虫病患者和先天性感染的新生儿，以及寄生虫血症低的情况，例如处于不确定阶段或病因不明的患者治疗。 PCR 检测也已用于心脏移植后克氏锥虫再激活的早期检测，并在临床再激活诊断之前记录了寄生负荷增加的检测。 此外，越来越多的临床和实验数据表明寄生虫血症和组织感染之间存在一定程度的相关性。 近年来的另一项重要进展是 TDR 赞助的研究，用于 T. cruzi 定性 PCR 检测的标准化和实验室验证。 选择了用于 PCR（标准和实时 PCR）定性评估的标准化程序，可产生更高的分析灵敏度和特异性、重现性，以及低水平的测定内和测定间变异和准确性。 11 月 8 日在布宜诺斯艾利斯举行的一次会议上公布了这项工作的结果，预计将在不久的将来公布。 然而，关于慢性不确定 CD 患者治疗效果的信息有限，只有少数研究采用 PCR 评估寄生虫反应。 在 DNDi 和 CD 协议开发团队主持的三场会议上，CD 专家小组支持评估 PCR 作为不确定慢性疾病寄生虫学反应的标记。 在这些讨论中，对于使用连续血液采集进行定性 PCR 检测以提高 PCR 检测灵敏度的价值达成共识。

支持此信息的数据仅限于 41 名孕妇的阿根廷队列，这些孕妇每月进行一次血液采集。 在这个小组中，单次采血的 PCR 灵敏度为 60.2%，2 次采血为 74%，3 次采血为 80.5%（A. Schijman，手稿正在准备中）。 此外，Castro 于 2002 年发表的一项研究表明，添加第二个样本后 PCR 的灵敏度从 70.0% 显着增加到 81.7% (P=0.03)。 添加第三个样品导致灵敏度无显着增加至 86.7%。 不幸的是，样本量很小，没有指示采样间隔，而且定性 PCR 技术是非标准化的。 在小组讨论期间，由于缺乏支持血液采样的明确间隔以最大化灵敏度的信息，因此没有就连续采样的精确间隔达成一致。 通过异种诊断获得的数据表明，慢性恰加斯人个体缺乏昼夜节律和 T. cruzi 周期性。 因此，在定义采样程序时，需要平衡 PCR 灵敏度和在现场进行临床试验的后勤/可行性方面的收益。 为了准备未来的 CD 临床试验，DNDi 承认需要评估和优化 PCR 实施程序，作为慢性不确定形式 CD 患者寄生虫学评估的工具。 将从 Médecins Sans Frontières 伦理审查委员会和 Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES)，玻利维亚科恰班巴的伦理审查委员会寻求研究伦理批准。 此外，该研究将由国家南美锥虫控制计划和玻利维亚卫生部的“Comité de Ética e Investigación”提交并审查。 这是一项描述性研究，旨在评估基线时的多次 PCR 血液采样程序与单次采样相比是否可以提供更高的灵敏度，以及它们在现场环境中的可行性。 基线和 EOT 的血液采样如下：一份 10 mL 的初始血样（样本 1），随后立即采集一份 5mL 的血样（样本 2）；加上 1 周后采集的一份 10mL 血样（样本 3）。 总共 3 个血样。 在 6 个月和 12 个月的随访中，将仅使用 EOT 时的最佳采样策略。

抽样策略：

为了根据血液样本的数量探索 PCR 的敏感性，PCR 结果将作为单一检测进行分析，并在数据分析阶段通过结合患者在给定时间点的 PCR 结果进行分析。

• 要使用的参考 当前策略 (CS)： 样品 1：10 毫升的单个样品 可以开发两种主要类型的策略并需要对其进行评估：
• 强化策略 (RS)，包括将血液采样添加到当前的单样本方法（10 毫升体积）中。 除非额外的采样不允许检测到额外的 PCR 阳性病例（这不太可能），否则这种策略将不可避免地比目前的策略更敏感。
• 替代策略 (SS)，包括用 5 毫升采样（样本 2）和可能的进一步采样（样本 3）替换当前方法（样本 1 = 10 毫升）。 这些策略不一定比当前策略更好。

研究地点：

本研究将在玻利维亚 Narciso Campero 省的 Aiquile、Omereque 和 Pasorapa 市的农村社区进行，无国界医生组织在那里与当地政府合作制定了“南美锥虫病预防、诊断和治疗”计划卫生当局。 当地人口约为 40,000 人，生活在该国 CD 负担最重的地区之一。 在该计划的背景下，将对居住在农村社区的个人进行南美锥虫病筛查，并邀请符合条件的人参加该研究。 无论是否参与研究，无国界医生及其合作伙伴将向所有南美锥虫病阳性受试者提供治疗和管理该疾病的平等机会。

主要准入标准：

纳入/排除具有苯并硝唑治疗适应症的慢性CD患者。 患者必须满足以下参加研究的资格标准：

纳入标准：

• 年龄在 > 18 - 60 岁之间
• 通过恰加斯血清学诊断 T. cruzi 感染。 三分之二的血清学检测必须呈阳性（常规 ELISA、重组 ELISA 或 HAI）
• 书面知情同意书

排除标准：

• 筛查时妊娠试验呈阳性或正在母乳喂养的育龄妇女注意：育龄妇女必须在试验的整个治疗阶段接受使用避孕方法
• 当前表现出严重的健康状况，例如：活动性肺结核和肝或肾衰竭的临床体征。
• Chagas 心肌病 II、III 和 IV 期（根据 NYHA 分类）
• 需要植入起搏器或其他严重心脏传导缺陷的受试者
• 过去任何时候使用苯并咪唑或硝呋替莫治疗 CD 的病史
• 无法遵守后续行动和/或没有永久地址
• 酗酒史或任何其他药物成瘾史 注意：所有参与本研究的患者都将按照无国界医生在 Aiquile 农村社区提供的常规护理，接受苯硝唑 5mg/Kg/天 PO BID 治疗 60 天。 这种处理符合玻利维亚卫生和体育部的当地建议。 患者参与本研究是自愿的，他在研究期间的任何时候拒绝或撤回同意不会影响他/她接受南美锥虫病治疗的权利。