Optimierung der PCR-Technik zur Beurteilung der parasitologischen Reaktion bei Patienten mit chronischer Chagas-Krankheit (PCR)

Die Chagas-Krankheit (CD) zählt zu den weltweit am meisten vernachlässigten Krankheiten. In Lateinamerika gibt es 21 Länder, in denen Zöliakie endemisch ist, wobei schätzungsweise 108 Millionen Menschen einem Risiko ausgesetzt sind, an der Krankheit zu erkranken. Schätzungen aus den 1980er Jahren zufolge waren etwa 16 bis 18 Millionen Menschen infiziert. In den 1990er Jahren wurden die Schätzungen der Zahl der Infizierten nach einer Reihe multinationaler Kontrollinitiativen auf 9,8 Millionen im Jahr 2001 revidiert. Die geschätzte Krankheitslast in Bezug auf behinderungsbereinigte Lebensjahre (DALYs) sank von 2,7 Millionen im Jahr 1990 auf 586.000 im Jahr 2001. Jüngste Schätzungen der Panamerikanischen Gesundheitsorganisation (PAHO) aus dem Jahr 2006 gehen von 7,54 Millionen Infizierten und 55.185 Neuerkrankungen pro Jahr aus. CD, auch bekannt als Amerikanische Trypanosomiasis, ist eine zoonotische Krankheit, die durch den einzelligen Hämoflagellaten Trypanosoma cruzi verursacht wird und hauptsächlich durch große, blutsaugende, reduviide Käfer der Unterfamilie Triatominae übertragen wird. Klinisch besteht die Zöliakie beim Menschen aus zwei Phasen, der akuten und der chronischen. Die akute Phase, die einige Wochen dauert, ist eine fieberhafte und toxische Erkrankung, bei der der Parasit durch direkte Untersuchung von frischem Blut nachgewiesen werden kann. In der chronischen Phase hängt die Diagnose von Blutkulturen unterschiedlicher Empfindlichkeit, Xenodiagnose, PCR oder dem Nachweis von IgG-Antikörpern ab. Unbehandelt bleibt die chronische Phase ein Leben lang bestehen. Sie beginnt etwa 10 bis 15 Jahre lang ohne spezifische Symptome oder klinische Manifestationen, die „unbestimmte Form“ der Krankheit. Etwa 20 bis 50 % der chronischen Chagas-Patienten entwickeln in den folgenden Jahren, je nach analysiertem Endemiegebiet, eine Beteiligung des Herzens oder des Magen-Darm-Trakts. Die derzeitige Therapie von CD ist auf zwei nitroheterozyklische Medikamente beschränkt, Nifurtimox und Benznidazol, wobei letzteres das am häufigsten verwendete Medikament zur Behandlung der Chagas-Krankheit ist. Die Indikationen für eine Behandlung sind akute Erkrankungen (einschließlich angeborener Infektionen) und frühe chronische Erkrankungen (d. h. bei Kindern unter 15 Jahren und Patienten in der frühen Phase einer chronischen Infektion) sowie eine Reaktivierung der Infektion durch Immunsuppression.

Die Behandlung der späten chronischen Phase liegt im Ermessen des Arztes. In einer Bedarfshierarchie wurde argumentiert, dass Patienten in der unbestimmten Phase der Krankheit die Hauptzielgruppe für die Bewertung neuer Behandlungen darstellen würden. Mit abnehmender Inzidenz der Krankheit ist selbst in Ländern mit der höchsten Anzahl neuer Fälle die höchste Krankheitslast bei Patienten in der asymptomatischen, chronischen Phase der Krankheit zu verzeichnen. In Bolivien beispielsweise sind mindestens 200.000 Kinder unter 15 Jahren und 1 Million Erwachsene mit T. cruzi infiziert, was einer geschätzten Gesamtzahl von 700.000 Menschen mit der unbestimmten Form oder der asymptomatischen, chronischen Phase entspricht. Die Entwicklung einer wirksamen und erschwinglichen Behandlung für Millionen von Menschen mit anhaltenden Infektionen und die Prävention chronischer Komplikationen gelten als eine der wichtigsten Prioritäten bei der Krankheitsbekämpfung bei Zöliakie. Die Beurteilung der Heilung gilt als der komplexeste Aspekt der Behandlung bei Zöliakie und führt oft zu unterschiedlichen und kontroversen Ergebnissen. Der Begriff parasitologische Heilung ist schwer zu interpretieren und die Bewertung schwierig, da eine vollständige Eliminierung von Parasiten nicht nur aus dem Blut, sondern auch aus dem Gewebe erforderlich ist. Die klinische Heilung erfordert eine langfristige Bewertung und ist aufgrund der Pathogenese der Krankheit oft ungewiss, da sich die Wirkung des Parasiten, die Reaktion des Wirts und die daraus resultierenden klinischen Manifestationen über lange Zeiträume entwickeln. In den letzten Jahren hat eine wachsende Datenmenge auf eine starke biologische Begründung für die Verwendung parasitologischer Ergebnisse als Ersatzmarker für die akute und unbestimmte Chagas-Krankheit hingewiesen. Es gibt zunehmend Belege für die Rolle der T. cruzi-Persistenz bei der Aufrechterhaltung der Immunantwort und der Entwicklung der Krankheit. Darüber hinaus haben aktuelle nicht-randomisierte klinische Studien mit Langzeit-Follow-up eine positive Wirkung einer antiparasitären Chemotherapie bei Patienten mit chronischer Zöliakie und die Korrelation dieser Ergebnisse mit serologischen Ergebnissen gezeigt. Daher wurde für die Zwecke der klinischen Entwicklung und des Wirksamkeitsnachweises vorgeschlagen, parasitologische und serologische Tests zur Beurteilung des Ansprechens sowohl bei akuten als auch bei chronischen Erkrankungen einzusetzen. Ein negativer Direktabstrich am Ende der Behandlung wird allgemein als Nachweis des Ansprechens bei Akutpatienten akzeptiert. Bei chronischen Erkrankungen können serielle Hämokultur, Xenodiagnose oder PCR zur Unterstützung der serologischen Beurteilung eingesetzt werden und ein positives parasitologisches Ergebnis weist auf ein Therapieversagen hin. Hämokultur und Xenodiagnose sind Techniken, die bei chronischen Patienten möglicherweise eine geringe Empfindlichkeit aufweisen. Sie erfordern geeignete Ressourcen/Infrastruktur und sehr kompetentes Personal. In Bezug auf die konventionelle Serologie kann es bei Patienten mit unklarer chronischer Erkrankung bis zu 5 Jahre dauern, bis die Antikörpertiter sinken, wobei nach 5–10 Jahren eine Serokonversion ins Negative auftritt. Daher wird vorgeschlagen, die Wirksamkeitsbewertung klinischer Studien bei unbestimmten Krankheiten mithilfe qualitativer und quantitativer PCR durchzuführen. Allerdings gab es in veröffentlichten Studien erhebliche Unterschiede in der klinischen Sensitivität und Spezifität der PCR, wobei Unterschiede zwischen den einzelnen Krankheitsphasen beobachtet wurden und eine Reihe von verwendeten Techniken eine Standardisierung erforderten. Insbesondere gab es Bedenken hinsichtlich der Empfindlichkeit der PCR bei chronischer Chagas-Krankheit aufgrund der geringen Menge zirkulierender Parasiten und natürlicher Schwankungen der Parasitämie. Neueste Studien haben einen breiten dynamischen Bereich für den PCR-Einsatz gezeigt, der direkte Messungen in Fällen mit hoher parasitärer Belastung, wie z. B. bei Patienten mit immunsupprimierter Chagas-Krankheit und angeboren infizierten Neugeborenen, sowie in Fällen mit geringer Parasitämie, wie z. B. Patienten in der unbestimmten Phase oder unter ätiologischer Erkrankung, ermöglicht Behandlung. PCR-Tests wurden auch zur Früherkennung einer T. cruzi-Reaktivierung nach einer Herztransplantation eingesetzt, wobei vor der Diagnose einer klinischen Reaktivierung ein Anstieg der Parasitenlast dokumentiert wurde. Darüber hinaus gibt es zunehmend klinische und experimentelle Daten, die auf einen gewissen Zusammenhang zwischen Parasitämie und Gewebeinfektion hinweisen. Ein weiterer wichtiger Fortschritt in den letzten Jahren war die vom TDR geförderte Studie zur Standardisierung und Laborvalidierung qualitativer PCR-Tests auf T. cruzi. Es wurden standardisierte Verfahren zur qualitativen Beurteilung der PCR (Standard- und Echtzeit-PCR) ausgewählt, die eine höhere analytische Sensitivität und Spezifität sowie Reproduzierbarkeit bei geringer Intra- und Inter-Assay-Variation und Genauigkeit bieten. Die Ergebnisse dieser Übung wurden am 8. November bei einem Treffen in Buenos Aires vorgestellt und werden voraussichtlich in naher Zukunft veröffentlicht. Es liegen jedoch nur begrenzte Informationen über die Wirksamkeit der Behandlung bei Patienten mit chronisch unbestimmter Zöliakie vor, und nur wenige Studien verwendeten PCR zur Beurteilung der parasitologischen Reaktion. Ein Expertengremium für CD unterstützte bei drei von DNDi und dem CD-Protokollentwicklungsteam veranstalteten Treffen die Bewertung der PCR als Marker für die parasitologische Reaktion bei unbestimmten chronischen Erkrankungen. Während dieser Diskussionen herrschte Konsens über den Wert der Verwendung serieller Blutentnahmen für qualitative PCR-Assays, um die Sensitivität von PCR-Tests zu erhöhen.

Die Daten, die diese Informationen stützen, beschränken sich auf eine argentinische Kohorte von 41 schwangeren Frauen, denen monatlich Blut entnommen wurde. In dieser kleinen Gruppe betrug die PCR-Sensitivität 60,2 % bei einer einzelnen Blutentnahme, 74 % bei zwei Blutentnahmen und 80,5 % bei drei Blutentnahmen (A. Schijman, Manuskript in Vorbereitung). Darüber hinaus zeigte eine 2002 veröffentlichte Studie von Castro einen signifikanten Anstieg der PCR-Sensitivität von 70,0 % auf 81,7 % durch die Zugabe einer zweiten Probe (P=0,03). Die Hinzufügung einer dritten Probe führte zu einer nicht signifikanten Erhöhung der Sensitivität auf 86,7 %. Leider war die Probengröße klein, es gab keine Angabe zum Probenintervall und die qualitative PCR-Technik war nicht standardisiert. Während der Podiumsdiskussionen konnte keine Einigung über das genaue Intervall für die Serienentnahme erzielt werden, da keine Informationen vorliegen, die ein bestimmtes Intervall für die Blutentnahme zur Maximierung der Empfindlichkeit unterstützen. Mit der Xenodiagnose gewonnene Daten deuten darauf hin, dass bei chronisch chagasischen Personen sowohl der zirkadiane Rhythmus als auch die T. cruzi-Periodizität fehlen. Daher müsste man bei der Definition von Probenahmeverfahren ein Gleichgewicht zwischen der Steigerung der PCR-Empfindlichkeit und der Logistik/Machbarkeit bei der Durchführung klinischer Studien in einer Feldumgebung abwägen. Um sich auf zukünftige klinische Studien zu CD vorzubereiten, erkennt DNDi die Notwendigkeit an, die Verfahren für die PCR-Implementierung als Instrument der parasitologischen Beurteilung bei Patienten mit chronisch unbestimmter Form von CD zu bewerten und zu optimieren. Die ethische Genehmigung der Studie wird beim Ethical Review Board von Médecins Sans Frontières und beim Ethical Review Board des Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolivien, eingeholt. Darüber hinaus wird die Studie vom Nationalen Chagas-Kontrollprogramm und dem „Comité de Ética e Investigación“ des Ministerio de Salud, Bolivien, eingereicht und geprüft. Hierbei handelt es sich um eine deskriptive Studie, die darauf abzielt, zu beurteilen, ob mehrere PCR-Blutentnahmeverfahren zu Studienbeginn eine höhere Sensitivität im Vergleich zur Einzelentnahme bieten können, sowie deren Durchführbarkeit in einer Feldumgebung. Die Blutentnahme für den Ausgangs- und EOT-Test erfolgt wie folgt: eine anfängliche Blutprobe von 10 ml (Probe 1), gefolgt von einer Blutprobe von 5 ml, die unmittelbar danach entnommen wird (Probe 2); plus eine Blutprobe von 10 ml, die eine Woche später entnommen wurde (Probe 3). Insgesamt 3 Blutproben. Bei den Nachuntersuchungen nach 6 und 12 Monaten wird nur die optimale Probenahmestrategie bei EOT verwendet.

Stichprobenstrategien:

Um die PCR-Empfindlichkeit entsprechend der Anzahl der Blutproben zu untersuchen, werden die PCR-Ergebnisse als Einzeltests sowie in der Datenanalysephase durch Kombination der PCR-Ergebnisse für Patienten zu einem bestimmten Zeitpunkt analysiert.

• Zu verwendende Referenz Aktuelle Strategie (CS): Probe 1: Einzelprobe von 10 ml Es können zwei Haupttypen von Strategien entwickelt werden, die einer Bewertung bedürfen:
• Verstärkungsstrategie (RS), die darin besteht, dem aktuellen Einzelprobenansatz (Volumen 10 ml) Blutentnahmen hinzuzufügen. Sofern zusätzliche Probennahmen nicht den Nachweis zusätzlicher PCR-positiver Fälle ermöglichen (was unwahrscheinlich ist), wird eine solche Strategie zwangsläufig empfindlicher sein als die derzeitige.
• Substitutionsstrategie (SS), die darin besteht, den aktuellen Ansatz (Probe 1 = 10 ml) durch eine 5-ml-Probenahme (Probe 2) und möglicherweise weitere Probe(n) (Probe 3) zu ersetzen. Diese Strategien sind nicht unbedingt besser als die aktuelle.

Studienort:

Die vorliegende Studie wird in ländlichen Gemeinden in den Gemeinden Aiquile, Omereque und Pasorapa in der Provinz Narciso Campero, Bolivien, durchgeführt, wo Ärzte ohne Grenzen in Zusammenarbeit mit den Einheimischen ein Programm zur „Prävention, Diagnose und Behandlung der Chagas-Krankheit“ eingerichtet hat Gesundheitsbehörden. Die lokale Bevölkerung beträgt etwa 40.000 Personen und lebt in einem der Gebiete mit der höchsten CD-Belastung des Landes. Im Rahmen dieses Programms werden Personen, die in ländlichen Gemeinden leben, auf die Chagas-Krankheit untersucht und diejenigen, die die Voraussetzungen dafür erfüllen, werden zur Teilnahme an der Studie eingeladen. Ärzte ohne Grenzen und seine Partner werden allen Chagas-positiven Probanden gleiche Möglichkeiten zur Behandlung und Behandlung der Krankheit bieten, unabhängig davon, ob sie an der Studie teilnehmen oder nicht.

Haupteintrittskriterien:

Einschluss/Ausschluss Patienten mit chronischer Zöliakie, bei denen eine Behandlung mit Benznidazol indiziert ist. Patienten müssen die folgenden Zulassungskriterien für die Aufnahme in die Studie erfüllen:

Einschlusskriterien:

• Alter zwischen > 18 – 60 Jahren
• Diagnose einer T. cruzi-Infektion durch Chagas-Serologie. Zwei von drei serologischen Tests müssen positiv sein (konventioneller ELISA, rekombinanter ELISA oder HAI).
• Schriftliche Einverständniserklärung

Ausschlusskriterien:

• Frauen im gebärfähigen Alter, deren Schwangerschaftstest beim Screening positiv ausfiel oder die stillen. Hinweis: Frauen im gebärfähigen Alter müssen sich damit einverstanden erklären, während der gesamten Behandlungsphase der Studie eine Verhütungsmethode anzuwenden
• Aktuelles Vorliegen eines schwerwiegenden Gesundheitszustands wie: aktive Lungentuberkulose und klinische Anzeichen von Leber- oder Nierenversagen.
• Chagas-Kardiomyopathie Stadium II, III und IV (nach NYHA-Klassifikation)
• Personen, die eine Herzschrittmacherimplantation oder andere schwere Herzleitungsstörungen benötigen
• Vorgeschichte einer Zöliakie-Behandlung mit Benznidazol oder Nifurtimox zu irgendeinem Zeitpunkt in der Vergangenheit
• Unfähigkeit, Folgemaßnahmen einzuhalten und/oder keine feste Adresse zu haben
• Vorgeschichte von Alkoholmissbrauch oder einer anderen Drogenabhängigkeit. Hinweis: Alle an dieser Studie teilnehmenden Patienten werden 60 Tage lang mit Benznidazol, 5 mg/kg/Tag p.o. 2-mal täglich, gemäß der routinemäßigen Pflege von Ärzte ohne Grenzen in ländlichen Gemeinden in Aiquile behandelt. Diese Behandlung entspricht den örtlichen Empfehlungen des Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. Die Teilnahme des Patienten an dieser Studie ist freiwillig und seine Weigerung oder der Widerruf seiner Einwilligung zu irgendeinem Zeitpunkt während der Studie hat keinen Einfluss auf sein Recht auf Behandlung der Chagas-Krankheit.