Ottimizzazione della tecnica PCR per valutare la risposta parassitologica per i pazienti con malattia di Chagas cronica (PCR)

La malattia di Chagas (CD) è tra le malattie più trascurate al mondo. In America Latina, 21 paesi sono endemici per CD con circa 108 milioni di persone a rischio di contrarre la malattia. Le stime degli anni '80 indicavano che circa 16-18 milioni di individui erano stati infettati. Negli anni '90, dopo una serie di iniziative di controllo multinazionali, le stime del numero di persone infette sono state riviste a 9,8 milioni nel 2001. Il carico stimato di malattia in termini di anni di vita aggiustati per la disabilità (DALY) è diminuito da 2,7 milioni nel 1990 a 586.000 nel 2001. Stime recenti dell'Organizzazione panamericana della sanità (PAHO), 2006, indicano 7,54 milioni di persone infette e 55.185 nuovi casi all'anno. CD, noto anche come tripanosomiasi americana, è una malattia zoonotica causata dal protozoo emoflagellato Trypanosoma cruzi che viene trasmesso principalmente da grandi insetti succhiatori di sangue e reduviidi della sottofamiglia Triatominae. Clinicamente, la CD umana ha due fasi, acuta e cronica. La fase acuta, che dura alcune settimane, è una malattia febbrile e tossiemica, durante la quale il parassita può essere individuato mediante esame diretto del sangue fresco. Nella fase cronica, la diagnosi dipende da emocolture di vario grado di sensibilità, xenodiagnosi, PCR o rilevazione di anticorpi IgG. Se non trattata, la fase cronica continua per il resto della vita di una persona. Inizia senza sintomi specifici o manifestazioni cliniche per un periodo di circa 10 o 15 anni, la "forma indeterminata" della malattia. Circa il 20-50% dei pazienti cronici di Chagas negli anni successivi, a seconda dell'area endemica analizzata, svilupperà un coinvolgimento del cuore o del tratto gastrointestinale. L'attuale terapia per la CD è limitata a due farmaci nitroeterociclici, Nifurtimox e Benznidazolo, quest'ultimo essendo il farmaco più utilizzato per il trattamento della malattia di Chagas. Le indicazioni per il trattamento sono la malattia acuta (incluse le infezioni congenite) e la malattia cronica precoce (cioè nei bambini < 15 anni di età e nei pazienti nella fase iniziale dell'infezione cronica), oltre alla riattivazione dell'infezione mediante immunosoppressione.

La fase cronica tardiva viene trattata a discrezione del medico. In una gerarchia di necessità, è stato sostenuto che i pazienti nella fase indeterminata della malattia rappresenterebbero la principale popolazione target per la valutazione di nuovi trattamenti. Con la diminuzione dell'incidenza della malattia, anche nei paesi con il maggior numero di nuovi casi, il carico di malattia più elevato è tra i pazienti nella fase asintomatica e cronica della malattia. La Bolivia, ad esempio, ha almeno 200.000 bambini di età inferiore ai 15 anni e 1 milione di adulti infetti da T. cruzi, per un totale stimato di 700.000 persone con la forma indeterminata o asintomatica, fase cronica. Lo sviluppo di cure efficaci e convenienti per milioni di persone con infezioni in corso e la prevenzione delle complicanze croniche sono riconosciute come priorità chiave per il controllo della malattia nella celiachia. La valutazione della cura è considerata l'aspetto più complesso del trattamento nella CD, portando a risultati spesso diversi e controversi. Il termine cura parassitologica è di difficile interpretazione e la valutazione impegnativa, alla luce della necessità di una totale eliminazione dei parassiti non solo dal sangue ma anche dai tessuti. La cura clinica richiede una valutazione a lungo termine ed è spesso di natura incerta a causa della patogenesi della malattia, con l'azione del parassita, la risposta dell'ospite e le loro conseguenti manifestazioni cliniche che evolvono per un lungo periodo di tempo. Negli ultimi anni un numero crescente di dati ha indicato una forte motivazione biologica per l'uso di esiti parassitologici come marcatori surrogati per la malattia di Chagas acuta e indeterminata. Vi è una crescente evidenza del ruolo della persistenza di T. cruzi nella perpetuazione della risposta immunitaria e nell'evoluzione della malattia. Inoltre, recenti studi clinici non randomizzati con follow-up a lungo termine hanno dimostrato un effetto positivo della chemioterapia antiparassitaria nei pazienti con celiachia cronica e la correlazione di questi risultati con i risultati sierologici. Pertanto, ai fini dello sviluppo clinico e del proof of concept, è stato suggerito di utilizzare test parassitologici e sierologici per la valutazione della risposta nelle malattie sia acute che croniche. Uno striscio diretto negativo alla fine del trattamento è generalmente accettato come prova di risposta nei pazienti acuti. Nelle malattie croniche, l'emocoltura seriale, la xenodiagnosi o la PCR possono essere utilizzate per supportare la valutazione sierologica e un risultato parassitologico positivo indica il fallimento del trattamento. L'emocoltura e la xenodiagnosi sono tecniche che possono presentare una bassa sensibilità nei pazienti cronici, richiedono risorse/infrastrutture adeguate e personale molto qualificato. Per quanto riguarda la sierologia convenzionale, con pazienti cronici indeterminati, una diminuzione dei titoli anticorpali può richiedere fino a 5 anni con sieroconversione in negativo che si verifica dopo 5-10 anni. Di conseguenza, si propone che la valutazione dell'efficacia per gli studi clinici nella malattia indeterminata sia effettuata con l'uso di PCR qualitativa e quantitativa. Tuttavia, c'è stata una variabilità significativa nella sensibilità clinica e nella specificità della PCR negli studi pubblicati, con differenze osservate tra le fasi della malattia e una serie di tecniche in uso che richiedono la standardizzazione. In particolare, vi è stata preoccupazione per quanto riguarda la sensibilità della PCR nella malattia cronica di Chagas a causa dei bassi livelli di parassiti circolanti e delle fluttuazioni naturali della parassitemia. Gli ultimi studi hanno mostrato un'ampia gamma dinamica per l'uso della PCR che consente misurazioni dirette in casi con elevati carichi parassitari come pazienti con malattia di Chagas immunosoppressi e neonati con infezione congenita, nonché in casi con basse parassitemie, come pazienti in fase indeterminata o in fase eziologica trattamento. Il test PCR è stato utilizzato anche per la diagnosi precoce della riattivazione di T. cruzi dopo il trapianto di cuore, con rilevamento documentato dell'aumento del carico parassitario, prima della diagnosi di riattivazione clinica. Inoltre, si stanno accumulando dati clinici e sperimentali che suggeriscono un grado di correlazione tra parassitemia e infezione tissutale. Un altro importante progresso negli ultimi anni è stato lo studio sponsorizzato da TDR per la standardizzazione e la convalida di laboratorio dei test PCR qualitativi per T. cruzi. Sono state selezionate procedure standardizzate per la valutazione qualitativa della PCR (PCR standard e in tempo reale) che producono una maggiore sensibilità e specificità analitica, riproducibilità, con bassi livelli di variazione e accuratezza intra e inter-saggio. I risultati di questo esercizio sono stati presentati in un incontro a Buenos Aires, l'8 novembre, e dovrebbero essere pubblicati nel prossimo futuro. Tuttavia, ci sono informazioni limitate sull'efficacia del trattamento per i pazienti con celiachia cronica indeterminata e solo pochi studi hanno utilizzato la PCR per valutare la risposta parassitologica. Un gruppo di esperti in CD in tre riunioni ospitate da DNDi e il team di sviluppo del protocollo CD hanno fornito supporto alla valutazione della PCR come marker per la risposta parassitologica nella malattia cronica indeterminata. Durante queste discussioni, c'è stato consenso sul valore dell'utilizzo di raccolte di sangue in serie per i test PCR qualitativi al fine di aumentare la sensibilità dei test PCR.

I dati a supporto di queste informazioni sono limitati a una coorte argentina di 41 donne in gravidanza seguite con prelievi di sangue mensili. In questo piccolo gruppo, la sensibilità della PCR è stata del 60,2% per un singolo prelievo, del 74% per 2 prelievi di sangue e dell'80,5% per 3 prelievi di sangue (A. Schijman, manoscritto in preparazione). Inoltre, uno studio di Castro pubblicato nel 2002 ha indicato un aumento significativo dal 70,0% all'81,7% della sensibilità della PCR con l'aggiunta di un secondo campione (P=0,03). L'aggiunta di un terzo campione ha portato a un aumento non significativo della sensibilità all'86,7%. Sfortunatamente, la dimensione del campione era ridotta, non vi era alcuna indicazione dell'intervallo di campionamento e la tecnica PCR qualitativa non era standardizzata. Durante le discussioni del panel, non vi è stato accordo sull'intervallo preciso per il campionamento seriale, in considerazione della mancanza di informazioni a sostegno di un intervallo definito per il prelievo di sangue per massimizzare la sensibilità. I dati ottenuti con la xenodiagnosi suggeriscono l'assenza sia del ritmo circadiano che della periodicità di T. cruzi negli individui chagasici cronici. Pertanto, quando si definiscono le procedure di campionamento, sarebbe necessario bilanciare il guadagno sulla sensibilità della PCR e la logistica/fattibilità nella conduzione di studi clinici in campo. Al fine di preparare futuri studi clinici sulla CD, DNDi riconosce la necessità di valutare e ottimizzare le procedure per l'implementazione della PCR come strumento di valutazione parassitologica nei pazienti con forma cronica indeterminata di CD. L'approvazione etica dello studio sarà richiesta dal Comitato di revisione etica di Medici Senza Frontiere e dal Comitato di revisione etica del Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolivia. Inoltre, lo studio sarà presentato e rivisto dal Programma nazionale di controllo del Chagas e dal "Comité de Ética e Investigación" del Ministerio de Salud, Bolivia. Questo è uno studio descrittivo che mira a valutare se più procedure di campionamento del sangue PCR al basale possono fornire una maggiore sensibilità rispetto al singolo campionamento, nonché la loro fattibilità in un ambiente di campo. Il prelievo di sangue per il basale e l'EOT sarà il seguente: un campione di sangue iniziale di 10 ml (campione 1), seguito da 1 campione di sangue di 5 ml raccolto immediatamente dopo (campione 2); più un campione di sangue di 10 ml raccolto 1 settimana dopo (campione 3). Totale di 3 campioni di sangue. Alle visite di follow-up a 6 e 12 mesi, verrà utilizzata solo la strategia di campionamento ottimale all'EOT.

Strategie di campionamento:

Al fine di esplorare la sensibilità della PCR in base al numero di campioni di sangue, i risultati della PCR saranno analizzati come singoli test e, nella fase di analisi dei dati, combinando i risultati della PCR per i pazienti in un determinato momento.

• Riferimento da utilizzare Strategia attuale (CS): Campione 1: campione singolo da 10 ml Possono essere sviluppati due tipi principali di strategie che richiedono una valutazione:
• Strategia di rinforzo (RS) che consiste nell'aggiungere prelievi di sangue all'attuale approccio a campione singolo (volume di 10 ml). A meno che ulteriori campionamenti non consentano il rilevamento di ulteriori casi positivi alla PCR (cosa improbabile), tale strategia sarà inevitabilmente più sensibile di quella attuale.
• Strategia di sostituzione (SS) che consiste nel sostituire l'attuale approccio (campione 1 = 10 ml) con un campionamento di 5 ml (campione 2) ed eventualmente ulteriori campionamenti (campione 3). Queste strategie non sono necessariamente migliori di quella attuale.

Sito di studio:

Il presente studio sarà condotto nelle comunità rurali dei comuni di Aiquile, Omereque e Pasorapa nella provincia di Narciso Campero, in Bolivia, dove Medici senza frontiere ha istituito un programma per la "prevenzione, diagnosi e cura della malattia di Chagas" in collaborazione con l'ente locale autorità sanitarie. La popolazione locale è di ~ 40.000 individui, che vivono in una delle aree con la più alta incidenza di CD nel paese. Nel contesto di questo programma, le persone che vivono nelle comunità rurali saranno sottoposte a screening per la malattia di Chagas e coloro che soddisfano l'idoneità saranno invitati a partecipare allo studio. Pari opportunità per il trattamento e la gestione della malattia saranno fornite da MSF e dai suoi partner a tutti i soggetti positivi al Chagas, indipendentemente dalla partecipazione o meno allo studio.

Principali criteri di accesso:

Inclusione/Esclusione Pazienti con MC cronica che hanno l'indicazione per il trattamento con benznidazolo. I pazienti devono soddisfare i seguenti criteri di ammissibilità per l'arruolamento nello studio:

Criterio di inclusione:

• Età compresa tra > 18 - 60 anni
• Diagnosi di infezione da T. cruzi mediante sierologia di Chagas. Due test sierologici su tre devono essere positivi (ELISA convenzionale, ELISA ricombinante o HAI)
• Modulo di consenso informato scritto

Criteri di esclusione:

• Donne in età riproduttiva che hanno un test di gravidanza positivo allo screening o che stanno allattando Nota: le donne in età riproduttiva devono accettare di utilizzare un metodo contraccettivo durante l'intera fase di trattamento della sperimentazione
• Presentazione attuale di gravi condizioni di salute come: tubercolosi polmonare attiva e segni clinici di insufficienza epatica o renale.
• Cardiomiopatia di Chagas stadio II, III e IV (secondo la classificazione NYHA)
• Soggetti che richiedono l'impianto di pacemaker o altri gravi difetti di conduzione cardiaca
• Storia di trattamento CD con benznidazolo o nifurtimox in qualsiasi momento nel passato
• Incapacità di rispettare il follow-up e/o mancanza di un indirizzo permanente
• Storia di abuso di alcol o qualsiasi altra dipendenza da droghe Nota: tutti i pazienti che partecipano a questo studio saranno trattati con Benznidazolo, 5 mg / kg / giorno PO BID per 60 giorni, come da cure di routine fornite da MSF nelle comunità rurali di Aiquile. Questo trattamento è conforme alle raccomandazioni locali del Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. La partecipazione del paziente a questo studio è volontaria e il suo rifiuto o ritiro del consenso in qualsiasi momento durante lo studio non pregiudicherà il suo diritto a ricevere cure per la malattia di Chagas.