A PCR-technika optimalizálása a krónikus Chagas-betegségben szenvedő betegek parazitológiai válaszának felmérésére (PCR)

A Chagas-kór (CD) a világ leginkább elhanyagolt betegségei közé tartozik. Latin-Amerikában 21 országban endemiás a CD, és a becslések szerint 108 millió embert veszélyeztet a betegség. Az 1980-as évek becslései szerint mintegy 16-18 millió ember fertőződött meg. Az 1990-es években egy sor multinacionális ellenőrzési kezdeményezés után a fertőzöttek számának becsléseit 2001-ben 9,8 millióra módosították. A becsült betegségteher a rokkantsághoz igazított életévekben (DALY) az 1990-es 2,7 millióról 2001-re 586 000-re csökkent. A Pánamerikai Egészségügyi Szervezet (PAHO) legutóbbi, 2006-os becslései 7,54 millió fertőzöttet és 55 185 új esetet jeleznek évente. A CD, más néven amerikai trypanosomiasis, a Trypanosoma cruzi hemoflagellát protozoon által okozott zoonózisos betegség, amelyet főként a Triatominae alcsaládba tartozó nagy, vérszívó, reduviid poloskák terjesztenek. Klinikailag az emberi CD-nek két fázisa van, akut és krónikus. A néhány hétig tartó akut fázis lázas és toxémiás megbetegedés, melynek során a parazita közvetlen friss vérvizsgálattal kimutatható. A krónikus szakaszban a diagnózis a különböző fokú érzékenységű hemokultúrákon, a xenodiagnosison, a PCR-en vagy az IgG antitestek kimutatásán múlik. Kezelés nélkül a krónikus szakasz az ember élete végéig folytatódik. Úgy kezdődik, hogy hozzávetőleg 10-15 évig nincsenek specifikus tünetek vagy klinikai megnyilvánulások, a betegség "meghatározatlan formája". A krónikus Chagas-betegek körülbelül 20-50%-ánál a következő évek során, az elemzett endémiás területtől függően, kialakul a szív vagy a gyomor-bél traktus érintettsége. A CD jelenlegi terápiája két nitroheterociklusos gyógyszerre korlátozódik, a Nifurtimoxra és a Benznidazolra, amely utóbbi a Chagas-betegség kezelésére legszélesebb körben használt gyógyszer. A kezelés indikációi az akut betegség (beleértve a veleszületett fertőzést) és a korai krónikus betegség (azaz 15 év alatti gyermekeknél és a krónikus fertőzés korai fázisában lévő betegeknél), valamint a fertőzés immunszuppresszióval történő újraaktiválása.

A késői krónikus fázis kezelése a klinikus belátása szerint történik. A szükségletek hierarchiájában azt állították, hogy a betegség meghatározatlan fázisában lévő betegek jelentik az új kezelések értékelésének fő célcsoportját. A betegség incidenciájának csökkenésével még a legtöbb új esettel rendelkező országokban is a betegség tünetmentes, krónikus fázisában lévő betegek körében a legnagyobb a betegségteher. Bolíviában például legalább 200 000 15 év alatti gyermek és 1 millió felnőtt fertőzött T. cruzi-val, ami becslések szerint összesen 700 000 embernek van meghatározatlan formája vagy tünetmentes, krónikus fázisa. A több millió folyamatos fertőzésben szenvedő ember hatékony és megfizethető kezelésének kidolgozása, valamint a krónikus szövődmények megelőzése a CD betegségkezelési prioritásai közé tartozik. A gyógyulás értékelése a CD kezelésének legösszetettebb aspektusa, amely gyakran változatos és ellentmondásos eredményekhez vezet. A parazitológiai gyógyítás kifejezés nehezen értelmezhető, értékelése pedig kihívást jelent annak fényében, hogy a parazitákat nemcsak a vérből, hanem a szövetekből is teljes mértékben el kell távolítani. A klinikai gyógyítás hosszú távú értékelést igényel, és a betegség patogeneziséből adódóan gyakran bizonytalan természetű, a parazita hatása, a gazdaválasz és az ebből következő klinikai megnyilvánulások hosszú ideig fejlődnek. Az elmúlt években egyre több adat mutatott rá arra, hogy a parazitológiai eredmények az akut és határozatlan Chagas-betegség helyettesítő markereként való felhasználásának erős biológiai okát támasztják alá. Egyre több bizonyíték áll rendelkezésre a T. cruzi perzisztencia szerepére az immunválasz fenntartásában és a betegség kialakulásában. Ezenkívül a közelmúltban végzett, hosszú távú követéssel végzett nem randomizált klinikai vizsgálatok kimutatták a parazitaellenes kemoterápia pozitív hatását krónikus CD-ben szenvedő betegeknél, és ezeknek az eredményeknek a korrelációját a szerológiai eredményekkel. Ezért a klinikai fejlesztés és a koncepció bizonyítása érdekében parazitológiai és szerológiai tesztek alkalmazását javasolták mind akut, mind krónikus betegségekre adott válasz értékelésére. A kezelés végén negatív közvetlen kenetet általában elfogadnak akut betegeknél a válasz bizonyítékaként. Krónikus betegségek esetén sorozatos hemokultúra, xenodiagnosis vagy PCR használható a szerológiai értékelés támogatására, és a pozitív parazitológiai eredmény a kezelés sikertelenségét jelzi. A hemokultúra és a xenodiagnosis olyan technikák, amelyek krónikus betegeknél alacsony érzékenységet mutatnak, megfelelő erőforrásokat/infrastruktúrát és nagyon hozzáértő személyzetet igényelnek. Ami a hagyományos szerológiát illeti, meghatározatlan krónikus betegeknél az antitesttiterek csökkenése akár 5 évig is eltarthat, míg a szerokonverzió negatívvá válik 5-10 év után. Következésképpen azt javasolják, hogy a meghatározatlan betegség klinikai vizsgálataiban a hatékonyság értékelését kvalitatív és kvantitatív PCR alkalmazásával végezzék el. A publikált tanulmányokban azonban jelentős eltérések mutatkoztak a PCR klinikai szenzitivitása és specificitása között, különbségek figyelhetők meg a betegség fázisai között, és számos szabványosítást igénylő technikát alkalmaznak. Különösen aggodalomra ad okot a PCR érzékenysége krónikus Chagas-betegségben a keringő paraziták alacsony szintje és a parazitémia természetes ingadozása miatt. A legújabb vizsgálatok széles dinamikus tartományt mutattak ki a PCR használatában, amely lehetővé teszi a közvetlen méréseket magas parazitaterhelésű esetekben, például immunszupprimált Chagas-kórban szenvedő betegeknél és veleszületett fertőzött újszülötteknél, valamint alacsony parazitaemiás esetekben, például meghatározatlan fázisú vagy etiológiás betegeknél. kezelés. A PCR-tesztet a T. cruzi szívátültetés utáni reaktiváció korai kimutatására is alkalmazták, dokumentáltan kimutatták a parazita terhelés növekedését a klinikai reaktiváció diagnosztizálása előtt. Ezenkívül felhalmozódnak a klinikai és kísérleti adatok, amelyek bizonyos fokú korrelációra utalnak a parazitaemia és a szöveti fertőzés között. Egy másik fontos előrelépés az elmúlt években a TDR által támogatott tanulmány a T. cruzi kvalitatív PCR-vizsgálatának szabványosítására és laboratóriumi validálására. A PCR (standard és valós idejű PCR) kvalitatív értékelésére szabványosított eljárásokat választottak, amelyek magasabb analitikai érzékenységet és specifitást, reprodukálhatóságot eredményeznek, alacsony szintű intra- és inter-assay variációval és pontossággal. A gyakorlat eredményeit egy november 8-i Buenos Aires-i találkozón mutatták be, és várhatóan a közeljövőben teszik közzé. A krónikus, határozatlan CD-s betegek kezelésének hatékonyságáról azonban korlátozott információ áll rendelkezésre, és csak néhány tanulmány alkalmazta PCR-t a parazitológiai válasz értékelésére. A CD-vel foglalkozó szakértői testület három, a DNDi és a CD-protokoll-fejlesztő csapat által szervezett találkozón támogatta a PCR mint a parazitológiai válasz markere értékelését meghatározatlan krónikus betegségekben. E megbeszélések során konszenzus alakult ki a sorozatos vérvételek minőségi PCR-vizsgálatokhoz való felhasználásának értékével kapcsolatban, a PCR-vizsgálat érzékenységének növelése érdekében.

Ezt az információt alátámasztó adatok egy 41 terhes nőből álló argentin kohorszra korlátozódnak, akiket havi vérvétellel követnek nyomon. Ebben a kis csoportban a PCR érzékenysége 60,2% volt egyszeri vételnél, 74% 2 vérvételnél és 80,5% 3 vérvételnél (A. Schijman, kézirat készül). Ezenkívül Castro 2002-ben publikált tanulmánya a PCR érzékenységének jelentős, 70,0%-ról 81,7%-ra történő növekedését jelezte egy második minta hozzáadásával (P=0,03). Egy harmadik minta hozzáadása az érzékenység nem szignifikáns, 86,7%-os növekedéséhez vezetett. Sajnos a minta mérete kicsi volt, nem volt feltüntetve a mintavételi intervallum, és a kvalitatív PCR technika nem volt szabványos. A panelbeszélgetések során nem volt egyetértés a sorozatos mintavétel pontos intervallumában, mivel nem álltak rendelkezésre olyan információk, amelyek alátámasztották volna a vérmintavétel határozott időközét az érzékenység maximalizálása érdekében. A xenodiagnosisszal nyert adatok arra utalnak, hogy krónikus chagasiás egyénekben nincs cirkadián ritmus és T. cruzi periodicitás. Ezért a mintavételi eljárások meghatározásakor egyensúlyba kell hozni a PCR-érzékenység és a logisztika/megvalósíthatóság előnyeit a klinikai vizsgálatok helyszíni környezetben történő elvégzése során. A jövőbeni CD-vel kapcsolatos klinikai vizsgálatokra való felkészülés érdekében a DNDi elismeri, hogy a PCR végrehajtási eljárásait értékelni és optimalizálni kell, mint a krónikus, határozatlan formájú CD parazitológiai értékelésének eszközét. A tanulmány etikai jóváhagyását a Médecins Sans Frontières Ethical Review Board-tól és az Etikai Felülvizsgálati Testülettől a Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolívia kérik. Ezenkívül a tanulmányt a National Chagas Control Program és a „Comité de Ética e Investigación” del Ministerio de Salud, Bolívia benyújtja és felülvizsgálja. Ez egy leíró tanulmány, amelynek célja annak felmérése, hogy az alapvonalon végzett többszörös PCR vérmintavételi eljárások nagyobb érzékenységet biztosítanak-e az egyszeri mintavételhez képest, valamint megvalósíthatóságukat helyszíni körülmények között. Az alapvonal és az EOT vérmintája a következő: egy kezdeti 10 ml-es vérminta (1. minta), majd egy 5 ml-es vérminta, amelyet közvetlenül azután vettünk (2. minta); plusz egy 10 ml-es vérmintát vettünk 1 héttel később (3. minta). Összesen 3 vérminta. A 6 és 12 hónapos utóellenőrzés során csak az EOT optimális mintavételi stratégiáját alkalmazzák.

Mintavételi stratégiák:

A vérminták számának megfelelő PCR-érzékenység feltárása érdekében a PCR-eredményeket egyedi vizsgálatként, valamint az adatelemzési szakaszban a betegek PCR-eredményeinek egy adott időpontban történő kombinálásával elemezzük.

• Használandó hivatkozás Jelenlegi stratégia (CS): 1. minta: Egyetlen 10 ml-es minta Két fő stratégiát lehet kidolgozni, amelyek értékelést igényelnek:
• Erősítési stratégia (RS), amely abból áll, hogy a jelenlegi egymintás megközelítéshez (10 ml-es térfogat) vérmintavétel(ek)et kell hozzáadni. Hacsak a további mintavételek nem teszik lehetővé további PCR-pozitív esetek kimutatását (ami nem valószínű), ez a stratégia elkerülhetetlenül érzékenyebb lesz, mint a jelenlegi.
• Helyettesítési stratégia (SS), amely abból áll, hogy a jelenlegi megközelítést (1. minta = 10 ml) 5 ml-es mintavétellel (2. minta) és esetleg további mintavétellel (3. minta) helyettesítik. Ezek a stratégiák nem feltétlenül jobbak a jelenleginél.

Tanulmányi helyszín:

A jelen tanulmányt a bolíviai Narciso Campero tartományban található Aiquile, Omereque és Pasorapa települések vidéki közösségeiben végzik majd el, ahol az Orvosok Határok Nélkül programot hozott létre a "Chagas-betegség megelőzésére, diagnosztizálására és kezelésére" a helyi hatóságokkal együttműködve. egészségügyi hatóságok. A helyi populáció körülbelül 40 000 egyed, amely az ország egyik legnagyobb CD-terheltségű térségében él. A program keretében a vidéki közösségekben élő egyéneket Chagas-kórra szűrik, és azokat, akik megfelelnek a jogosultságnak, meghívják a vizsgálatban való részvételre. Az MSF és partnerei egyenlő esélyeket biztosítanak a betegség kezelésében és kezelésében minden Chagas-pozitív alanynak, függetlenül attól, hogy részt vettek a vizsgálatban vagy sem.

Fő belépési feltételek:

Bevétel / kizárás Krónikus CD-ben szenvedő betegek, akiknél a benznidazol-kezelés javallata. A betegeknek meg kell felelniük a következő alkalmassági kritériumoknak a vizsgálatba való felvételhez:

Bevételi kritériumok:

• Életkor > 18-60 év
• A T. cruzi fertőzés diagnózisa Chagas szerológiával. Három szerológiai tesztből kettőnek pozitívnak kell lennie (hagyományos ELISA, rekombináns ELISA vagy HAI)
• Írásbeli tájékoztatáson alapuló beleegyezési űrlap

Kizárási kritériumok:

• Reproduktív korban lévő nők, akiknek terhességi tesztje pozitív a szűréskor, vagy akik szoptatnak Megjegyzés: A reproduktív korban lévő nőknek el kell fogadniuk a fogamzásgátló módszer alkalmazását a vizsgálat teljes kezelési szakasza alatt
• A súlyos egészségi állapot jelenlegi bemutatása, mint például: aktív tüdőtuberkulózis és a máj- vagy veseelégtelenség klinikai tünetei.
• Chagas cardiomyopathia II, III és IV stádium (NYHA osztályozás szerint)
• Olyan alanyok, akiknél pacemaker beültetésre van szükség, vagy más súlyos szívvezetési rendellenességben szenvednek
• A múltban bármikor előfordult benznidazollal vagy nifurtimoxszal végzett CD-kezelés
• Képtelenség betartani a nyomon követést és/vagy nincs állandó lakcíme
• Alkohollal való visszaélés vagy bármilyen más kábítószer-függőség anamnézisében Megjegyzés: A vizsgálatban részt vevő összes beteget benznidazollal kezelik, 5 mg/kg/nap PO BID 60 napon keresztül, az MSF által az aiquilei vidéki közösségekben nyújtott rutinkezelés szerint. Ez a kezelés összhangban van a Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia helyi ajánlásaival. A beteg részvétele ebben a vizsgálatban önkéntes, és beleegyezésének megtagadása vagy visszavonása a vizsgálat során nem érinti a Chagas-kór kezeléséhez való jogát.