Optimering av PCR-teknik för att bedöma parasitologisk respons för patienter med kronisk Chagas-sjukdom (PCR)

Chagas sjukdom (CD) rankas bland världens mest försummade sjukdomar. I Latinamerika är 21 länder endemiska för CD med uppskattningsvis 108 miljoner människor som riskerar att drabbas av sjukdomen. Uppskattningar från 1980-talet visade att cirka 16-18 miljoner individer var smittade. På 1990-talet, efter en rad multinationella kontrollinitiativ, reviderades uppskattningarna av antalet smittade personer till 9,8 miljoner år 2001. Den uppskattade sjukdomsbördan i termer av funktionsnedsättningsjusterade levnadsår (DALY) minskade från 2,7 miljoner 1990 till 586 000 2001. Färska uppskattningar från Pan-American Health Organization (PAHO), 2006, indikerar 7,54 miljoner infekterade människor och 55 185 nya fall per år. CD, även känd som amerikansk trypanosomiasis, är en zoonotisk sjukdom som orsakas av protozoen hemoflagellat Trypanosoma cruzi som huvudsakligen överförs av stora, blodsugande, reduviida insekter från underfamiljen Triatominae. Kliniskt har human CD två faser, akut och kronisk. Den akuta fasen, som varar några veckor, är en febril och toxemisk sjukdom, under vilken parasiten kan upptäckas genom direkt undersökning av färskt blod. I den kroniska fasen beror diagnosen på hemokulturer med varierande grad av känslighet, xenodiagnos, PCR eller påvisande av IgG-antikroppar. Obehandlad fortsätter den kroniska fasen för resten av en persons liv. Det börjar utan några specifika symtom eller kliniska manifestationer under en period av cirka 10 eller 15 år, den "obestämda formen" av sjukdomen. Omkring 20 till 50 % av kroniska Chagas-patienter under de efterföljande åren, beroende på det endemiska området som analyseras, kommer att utveckla inblandning i hjärtat eller mag-tarmkanalen. Nuvarande terapi för CD är begränsad till två nitroheterocykliska läkemedel, Nifurtimox och Benznidazol, det senare är det mest använda läkemedlet för behandling av Chagas sjukdom. Indikationerna för behandling är akut sjukdom (inklusive medfödd infektion) och tidig kronisk sjukdom (det vill säga hos barn < 15 år och patienter i den tidiga fasen av kronisk infektion), plus reaktivering av infektionen genom immunsuppression.

Sen kronisk fas behandlas efter läkarens gottfinnande. I en behovshierarki har det hävdats att patienter i den obestämda fasen av sjukdomen skulle representera den huvudsakliga målpopulationen för utvärdering av nya behandlingar. Med minskande incidens av sjukdomen, även i länder med det högsta antalet nya fall, är den högsta sjukdomsbördan bland patienter i den asymtomatiska, kroniska fasen av sjukdomen. Bolivia har till exempel minst 200 000 barn under 15 år och 1 miljon vuxna infekterade med T. cruzi, för uppskattningsvis totalt 700 000 personer med den obestämda formen eller asymtomatisk, kronisk fas. Utvecklingen av effektiv och prisvärd behandling för miljontals människor med pågående infektioner och förebyggande av kroniska komplikationer är erkänt som en nyckelprioritet för sjukdomskontroll inom CD. Utvärderingen av bot anses vara den mest komplexa aspekten av behandling vid CD, vilket leder till ofta olika och kontroversiella resultat. Termen parasitologisk bot är svårtolkad och utvärderingen utmanande, i ljuset av behovet av total eliminering av parasiter inte bara från blod utan också från vävnad. Kliniskt botemedel kräver långtidsutvärdering och är ofta av osäker karaktär på grund av sjukdomens patogenes, med parasitens verkan, värdresponsen och deras åtföljande kliniska manifestationer som utvecklas under långa perioder. Under de senaste åren har en ökande mängd data pekat på ett starkt biologiskt skäl för användningen av parasitologiska resultat som surrogatmarkörer för akut och obestämd Chagas sjukdom. Det finns allt fler bevis på rollen av T. cruzis uthållighet i upprätthållandet av immunsvaret och utvecklingen av sjukdomen. Nya icke-randomiserade kliniska prövningar med långtidsuppföljning har också visat en positiv effekt från antiparasitisk kemoterapi hos patienter med kronisk CD och korrelationen mellan dessa fynd och serologiska resultat. Därför har det, för klinisk utveckling och proof-of-concept, föreslagits att parasitologiska och serologiska tester används för bedömning av respons vid både akut och kronisk sjukdom. Ett negativt direkt utstryk i slutet av behandlingen är allmänt accepterat som bevis på svar hos akuta patienter. Vid kronisk sjukdom kan seriell hemokultur, xenodiagnos eller PCR användas för att stödja serologisk bedömning och ett positivt parasitologiskt resultat indikerar behandlingsmisslyckande. Hemokultur och xenodiagnos är tekniker som kan uppvisa låg känslighet hos kroniska patienter, de kräver ordentliga resurser/infrastruktur och mycket skicklig personal. När det gäller konventionell serologi, med obestämda kroniska patienter, kan en minskning av antikroppstitrar ta upp till 5 år med serokonvertering till negativ efter 5-10 år. Som en konsekvens föreslås det att effektbedömning för kliniska studier vid obestämd sjukdom görs med användning av kvalitativ och kvantitativ PCR. Det har dock funnits betydande variationer i den kliniska känsligheten och specificiteten för PCR i publicerade studier, med skillnader som ses över olika faser av sjukdomen och ett antal tekniker som används som kräver standardisering. I synnerhet har det funnits oro beträffande PCR-känsligheten vid kronisk Chagas sjukdom på grund av de låga nivåerna av cirkulerande parasiter och naturliga fluktuationer av parasitemi. De senaste studierna har visat ett brett dynamiskt område för PCR-användning som tillåter direkta mätningar i fall med hög parasitbelastning såsom patienter med immunsupprimerad Chagas sjukdom och medfödda infekterade nyfödda, såväl som i fall med låga parasiter, såsom patienter i den obestämda fasen eller under etiologisk behandling. PCR-testning har också använts för tidig upptäckt av T. cruzi-reaktivering efter hjärttransplantation, med dokumenterad upptäckt av parasitisk belastningsökning, före diagnos av klinisk reaktivering. Dessutom finns det insamlade kliniska och experimentella data som tyder på en grad av korrelation mellan parasitemi och vävnadsinfektion. Ett annat viktigt framsteg på senare år har varit den TDR-sponsrade studien för standardisering och laboratorievalidering av kvalitativ PCR-testning för T. cruzi. Standardiserade procedurer för kvalitativ bedömning av PCR (standard- och realtids-PCR) som ger högre analytisk känslighet och specificitet, reproducerbarhet, med låga nivåer av intra- och inter-assay variation och noggrannhet har valts ut. Resultaten från denna övning har presenterats vid ett möte i Buenos Aires den 8 november och de förväntas publiceras inom en snar framtid. Det finns dock begränsad information om effektiviteten av behandling för kroniska obestämda CD-patienter, och endast ett fåtal studier använde PCR för att bedöma parasitologisk respons. En panel av experter på CD gav vid tre möten värd för DNDi och CD-protokollutvecklingsteamet stöd till utvärderingen av PCR som en markör för parasitologisk respons vid obestämd kronisk sjukdom. Under dessa diskussioner rådde konsensus om värdet av att använda seriella blodsamlingar för kvalitativa PCR-analyser för att öka PCR-testningskänsligheten.

Data till stöd för denna information är begränsade till en argentinsk kohort av 41 gravida kvinnor som följs upp med månatliga blodinsamlingar. I denna lilla grupp var PCR-känsligheten 60,2 % för en enda samling, 74 % för 2 blodprovtagningar och 80,5 % för 3 blodprovtagningar (A. Schijman, manuskript under förberedelse). Dessutom indikerade en studie från Castro publicerad 2002 en signifikant ökning från 70,0 % till 81,7 % i känsligheten för PCR med tillägg av ett andra prov (P=0,03). Tillsatsen av ett tredje prov ledde till icke-signifikant ökning av känsligheten till 86,7 %. Tyvärr var provstorleken liten, det fanns ingen indikation på provtagningsintervallet och den kvalitativa PCR-tekniken var icke-standardiserad. Under paneldiskussionerna rådde ingen överenskommelse om det exakta intervallet för serieprovtagning, med tanke på bristen på information till stöd för ett bestämt intervall för blodprovstagning för att maximera känsligheten. Data erhållna med xenodiagnos tyder på frånvaron av både dygnsrytm och T. cruzi periodicitet hos kroniska chagasiska individer. Därför, när man definierar provtagningsprocedurer, skulle man behöva balansera vinsten på PCR-känslighet och logistik/genomförbarhet vid genomförande av kliniska prövningar i fältmiljö. För att förbereda sig för framtida kliniska prövningar på CD, erkänner DNDi behovet av att utvärdera och optimera procedurerna för PCR-implementering som ett verktyg för parasitologisk bedömning hos patienter med kronisk obestämd form av CD. Studieetiskt godkännande kommer att sökas från Läkare Utan Gränsers etiska granskningsnämnd och etiska granskningsnämnden från Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolivia. Dessutom kommer studien att lämnas in och granskas av det nationella Chagas kontrollprogram och 'Comité de Ética e Investigación' del Ministerio de Salud, Bolivia. Detta är en beskrivande studie som syftar till att bedöma om flera PCR-blodprovsprocedurer vid baslinjen kan ge högre känslighet jämfört med enstaka provtagningar, såväl som deras genomförbarhet i fält. Blodprovtagning för baslinje och EOT kommer att vara enligt följande: ett initialt blodprov på 10 mL (prov 1), följt av 1 blodprov på 5 mL som tas omedelbart efter (prov 2); plus ett blodprov på 10 ml samlat 1 vecka senare (prov 3). Totalt 3 blodprover. Vid 6 och 12 månaders uppföljningsbesök kommer endast den optimala provtagningsstrategin vid EOT att användas.

Samplingsstrategier:

För att undersöka PCR-känslighet enligt antalet blodprover kommer PCR-resultaten att analyseras som enstaka analyser samt, vid dataanalysstadiet, genom att kombinera PCR-resultat för patienter vid en given tidpunkt.

• Referens som ska användas Nuvarande strategi (CS): Prov 1: Enstaka prov på 10 ml Två huvudtyper av strategier kan utvecklas och behöver en bedömning:
• Förstärkningsstrategi (RS) som består i att lägga till blodprovstagning(er) till den nuvarande metoden med enstaka prov (volym 10 ml). Om inte ytterligare provtagningar inte tillåter detektering av ytterligare PCR-positiva fall (vilket är osannolikt) kommer en sådan strategi oundvikligen att vara känsligare än den nuvarande.
• Substitutionsstrategi (SS) som består i att ersätta det nuvarande tillvägagångssättet (prov 1 = 10 ml) med en 5 ml provtagning (prov 2) och eventuellt ytterligare provtagning(er) (prov 3). Dessa strategier är inte nödvändigtvis bättre än den nuvarande.

Studiewebbplats:

Den föreliggande studien kommer att genomföras på landsbygden i kommunerna Aiquile, Omereque och Pasorapa i provinsen Narciso Campero, Bolivia, där Läkare Utan Gränser har etablerat ett program för "förebyggande, diagnos och behandling av Chagas sjukdomar" i samarbete med de lokala hälsomyndigheter. Den lokala befolkningen är ~ 40 000 individer, som bor i ett av de områden med högst belastning av CD i landet. Inom ramen för detta program kommer individer som bor på landsbygden att screenas för Chagas sjukdom och de som uppfyller behörighet kommer att bjudas in att delta i studien. Lika möjligheter för behandling och hantering av sjukdomen kommer att ges av Läkare Utan Gränser och dess partners till alla Chagas positiva försökspersoner, trots deltagande eller inte i studien.

Huvudinträdeskriterier:

Inkludering / Exklusion Patienter med kronisk CD som har indikation för behandling med bensnidazol. Patienter måste uppfylla följande behörighetskriterier för att delta i studien:

Inklusionskriterier:

• Ålder mellan > 18 - 60 år
• Diagnos av T. cruzi-infektion genom Chagas-serologi. Två av tre serologiska tester måste vara positiva (konventionell ELISA, rekombinant ELISA eller HAI)
• Skriftligt informerat samtycke

Exklusions kriterier:

• Kvinnor i fertil ålder som har ett positivt graviditetstest vid screening eller som ammar Obs: Kvinnor i fertil ålder måste acceptera att använda en preventivmetod under hela behandlingsfasen av studien
• Aktuell presentation av allvarligt hälsotillstånd såsom: aktiv lungtuberkulos och kliniska tecken på lever- eller njursvikt.
• Chagas kardiomyopati stadium II, III och IV (enligt NYHA-klassificeringen)
• Försökspersoner som kräver pacemakerimplantation eller andra allvarliga hjärtledningsfel
• Historik av CD-behandling med bensnidazol eller nifurtimox någon gång i det förflutna
• Oförmåga att följa uppföljning och/eller inte ha en fast adress
• Historik med alkoholmissbruk eller något annat drogberoende Obs: alla patienter som deltar i denna studie kommer att behandlas med Benznidazol, 5 mg/kg/dag PO BID i 60 dagar, enligt rutinvård från Läkare Utan Gränser på landsbygden i Aiquile. Denna behandling är i enlighet med lokala rekommendationer från Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. Patientens deltagande i denna studie är frivillig och hans vägran eller återkallande av samtycke när som helst under studien kommer inte att påverka hans/hennes rätt att få behandling för Chagas sjukdom.