エッセンシャル オイルと 0.2% クロルヘキシジンの口腔バイオ フィルム成長の in situ モデルに対する抗歯垢効果。

ボランティアは、6枚のガラスディスク（直径6mm、厚さ1mm）を保持できる2つの個別の添え木を着用しました。これは800グリットで磨かれました。 . これらのスプリントは、ディスクが取り付けられる内側の 1 mm のソフト ビニール シートと、窓付きのポリエチレン テレフタレート製の外側の 1 mm の硬質シートの 2 枚のシートで形成されます。

• マウスウォッシュ プロトコル 各研究コースの 96 時間 (4 日間) の期間中、各ボランティアはガラス ディスクを装着したスプリントを着用し、食事中のみ口腔から引き抜きました (湿った状態で不透明な容器に保管されていました)。歯磨き粉やマウスウォッシュを使用せずに、水による細菌プラークの機械的除去のみを使用して、口腔衛生手順を実行します。

許可された機械的な口腔衛生対策 (スプリントなし) を使用して、ボランティアは、朝 (8:30) の朝食後と夜 ( 22.00) 夕食後:

A) 1 日 2 回、20 ml をエッセンシャル オイルで 30 秒間すすぎます。 ----14 日間---- B) 10 mL を 0.2% クロルヘキシジンで 30 秒間すすぎ、1 日 2 回。 ----14 日---- C) 20 mL を滅菌水で 30 秒間すすぐ (ネガティブ コントロール)。 各被験者が 1 回目、2 回目、3 回目に使用するマウスウォッシュを示すインターネットベースのバランスのとれた無作為化システムを使用して、すべてのボランティアが 3 回のすすぎサイクルを実行し、各テストの間に 14 日間の休息期間がありました。

• プラーク様バイオフィルムのサンプルの収集 各ボランティアのサンプルが異なる日に分析されるように、サンプルの収集は午前 8 時に個別に行われました。 前夜の最後のうがい薬から最低 10 時間経過する必要があると判断されました。

ガラスディスクをスプリントから外したら、すぐに 100 µL の蛍光溶液 LIVE/DEAD® BacLight™ に浸し、室温の暗室に 15 分間置きました。 顕微鏡観察は、HCX APOL 63x/0.9 を備えた Leica TCS SP2 レーザー走査型スペクトル共焦点顕微鏡 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH、マンハイム、ドイツ) を使用して、研究デザインを知らなかった 1 人の研究者によって行われました。 水浸レンズ。

• プラーク様バイオフィルムのサンプルの処理 各ディスクの中央部分の 4 つの選択されたフィールドまたは XYZ シリーズを評価しました。 これらのフィールドは、観察者の一般的な検査の後、サンプル全体を代表すると見なされました。 蛍光発光は、各画像が各 Z 位置 (深さ) に対応する一連の XY 画像で決定されました。 光学切片は、バイオ フィルムの表面からその基部まで 1 μ m のセクションでスキャンされ、フィールドの最大厚さを測定し、その後、対応するサンプルのバイオ フィルムの平均厚さを測定しました。 バイオ フィルム フィールドの最大厚さは、基板 (垂直方向) と最も高い細胞クラスターのピークとの間の距離として定義されました。 各フィールドの最大バイオ フィルムの厚さは、3 つのゾーンまたは同等の層に分割されました: 外層 (レイヤー 1)、中間層 (レイヤー 2)、内層 (レイヤー 3)。

データのキャプチャは、すべてのケースで同じ設定で行われました。 空間スキャン モード (XYZ) と 1024x1024 ピクセルのスキャン形式の解像度が使用されました。 アルゴン イオンと DPSS レーザーは、それぞれ最大強度の 13% と 78% で使用されました。 ピンホール、ズーム、およびスキャン速度の値は、それぞれ 121.58 ミクロン、1 および 400Hz でした。 サンプルによって異なる唯一の値は、オフセット (-1% から 1% の範囲) とチャネルの赤と緑で異なる PMT ゲインでした。一般的に、赤よりも緑の方が高くなります (テストとポジティブコントロール）、赤のシグナルよりも緑のシグナルの方が多いという事実により、ネガティブコントロールは反対です。 これらの値は、バックグラウンド ノイズのない高品質のキャプチャを得るために常に調整され、画像の最も明るいピクセルの過度の飽和を回避します。 技術者は実験を知らなかったので、顕微鏡の対物レンズで見ているものと常に一致するように調整し、できるだけ現実に近い画像を取得するようにアドバイスされました.

一連の XY 画像における細菌の活力の定量化は、細胞蛍光分析 (Leica Confocal Software) を使用して決定されました。 この分析では、各蛍光色素の画像を「チャネル」として定義しました (SYTO 9 は緑のチャネルを占有し、ヨウ化プロピジウムは赤のチャネルを占有します)。 正方形のキャプチャ マスクを使用して、各チャネルのピクセルが占める面積 (µm2) を測定し、バイオ フィルムが占める総面積と、対応する活力のパーセンテージを決定しました。 陽性シグナルと見なされた強度範囲は 100 ～ 255 でした。 各フィールドの細菌活力の平均パーセンテージの決定には、バイオフィルムの最小面積が 250 µm2 のセクションが必要であり、バイオフィルムのバクテリア活力の平均パーセンテージは、対応するサンプルと各バイオフィルム層について計算されました。

バイオ フィルム (カバー グレード) によって覆われた表面基板の割合の定量化には、サイトフルオロ グラム自体が使用されました。 分析されたフィールドのそれぞれの最大投影 (キャプチャされたすべての平面の重ね合わせ) から、フィールドの総表面積に関する細菌量 (バイタルおよび非バイタル) の合計を計算することによって、被覆グレードのパーセンテージが得られました (総面積内の陽性率)。