Effetto antiplacca degli oli essenziali e clorexidina allo 0,2% su un modello in situ di crescita del biofilm orale.

I volontari indossavano due stecche individualizzate in grado di contenere 6 dischi di vetro (6 mm di diametro, 1 mm di spessore); questo è stato lucidato a grana 800. . Queste stecche sono formate da 2 fogli, uno interno in vinile morbido da 1 mm dove sono fissati i dischetti e uno esterno rigido da 1 mm in polietilene tereftalato che è fenestrato.

• Protocollo collutorio Durante le 96 ore (4 giorni) di ciascun corso di studio, ogni volontario ha indossato le stecche con i dischi di vetro, ritirandole dal cavo orale solo durante i pasti (sono state conservate in un contenitore opaco in condizioni umide) e per eseguire procedure di igiene orale, utilizzando solo la rimozione meccanica della placca batterica con acqua, senza l'uso di alcun dentifricio o collutorio.

Utilizzando le misure di igiene orale meccanica consentite (senza le stecche), i volontari hanno eseguito i seguenti protocolli in base alle istruzioni dei produttori, con le stecche nella cavità orale, durante i 4 giorni al mattino (8.30) dopo la colazione e alla sera ( 22.00) dopo cena:

A) 20 ml di risciacquo per 30 secondi con oli essenziali/2 volte al giorno. ----14 giorni---- B) 10 ml di risciacquo per 30 secondi con clorexidina allo 0,2%/2 volte al giorno. ----14 giorni---- C) 20 ml di risciacquo per 30 secondi con acqua sterile (controllo negativo). Utilizzando un sistema di randomizzazione bilanciato basato su Internet, indicando il collutorio che ciascun soggetto avrebbe utilizzato per primo, secondo e terzo, tutti i volontari hanno eseguito i 3 cicli di risciacquo, con un periodo di riposo di 14 giorni tra ogni test.

• Raccolta dei campioni di Plaque like-biofilm La raccolta dei campioni è stata effettuata individualmente alle 8 del mattino, in modo che i campioni di ciascun volontario fossero analizzati in giorni diversi. È stato stabilito che dovrebbero essere trascorse almeno 10 ore dall'ultimo collutorio della notte precedente.

Quando i dischi di vetro sono stati rimossi dallo splint, sono stati immediatamente immersi in 100 µL di soluzione fluorescente LIVE/DEAD® BacLight™ e conservati in una camera oscura a temperatura ambiente per 15 minuti. L'osservazione microscopica è stata eseguita da un singolo ricercatore che non era a conoscenza del disegno dello studio, utilizzando un microscopio confocale spettrale a scansione laser Leica TCS SP2 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Germania) con un HCX APOL 63x/0.9 lente per immersione in acqua.

• Elaborazione dei campioni di Plaque like-Biofilm Sono stati valutati quattro campi selezionati o serie XYZ nella parte centrale di ciascun disco. Questi campi sono stati considerati rappresentativi dell'intero campione dopo l'esame generale dell'osservatore. L'emissione di fluorescenza è stata determinata in una serie di immagini XY in cui ciascuna immagine corrispondeva a ciascuna delle posizioni Z (profondità). Le sezioni ottiche sono state scansionate in sezioni di 1 µm dalla superficie del biofilm alla sua base, misurando lo spessore massimo del campo e successivamente lo spessore medio del biofilm del campione corrispondente. Lo spessore massimo del campo di biofilm è stato definito come la distanza tra il substrato (in perpendicolare) e i picchi dei cluster cellulari più alti. Lo spessore massimo del biofilm di ciascun campo è stato suddiviso in 3 zone o strati equivalenti: strato esterno (strato 1), strato intermedio (strato 2) e strato interno (strato 3).

L'acquisizione dei dati è stata effettuata con le stesse impostazioni in tutti i casi. Sono state utilizzate la modalità di scansione spaziale (XYZ) e la risoluzione del formato di scansione di 1024x1024 pixel. Il laser Argon-ion e DPSS sono stati utilizzati rispettivamente al 13% e al 78% dell'intensità massima. I valori per il foro stenopeico, lo zoom e la velocità di scansione erano rispettivamente di 121,58 micron, 1 e 400 Hz. Gli unici valori che differivano a seconda del campione erano l'offset (intervallo compreso tra -1% e 1%) e il guadagno PMT che era diverso per il canale rosso e verde, essendo in termini generali più alto per il verde che per il rosso (test e positivo controllo), dovuto al fatto che c'era più presenza di segnale verde che rosso, essendo per il controllo negativo il contrario. Questi valori sono stati sempre regolati per ottenere una cattura di buona qualità senza rumore di fondo, evitando un'eccessiva saturazione dei pixel più luminosi dell'immagine. Poiché il tecnico non vedeva l'esperimento, è stato consigliato di effettuare le regolazioni sempre coerenti con quanto vedeva l'obiettivo del microscopio, ottenendo un'immagine il più possibile fedele alla realtà.

La quantificazione della vitalità batterica nella serie di immagini XY è stata determinata mediante analisi citofluorografica (Leica Confocal Software). In questa analisi, le immagini di ciascun fluorocromo sono state definite come "canali" (SYTO 9 occupa il canale verde e ioduro di propidio il canale rosso). Sono state utilizzate maschere di cattura quadrate per misurare l'area occupata (µm2) dai pixel in ciascun canale, determinando l'area totale occupata dal biofilm e la corrispondente percentuale di vitalità. Gli intervalli di intensità considerati come segnale positivo erano compresi tra 100 e 255. La determinazione della percentuale media di vitalità batterica in ciascun campo ha richiesto sezioni con un'area minima di biofilm di 250 µm2, e la percentuale media di vitalità batterica del biofilm è stata calcolata per il campione corrispondente e per ogni strato di biofilm.

Per quantificare la percentuale di substrato superficiale coperto dal biofilm (grado di copertura), è stato utilizzato il citofluorogramma stesso. Dalla massima proiezione (sovrapposizione di tutti i piani catturati) di ciascuno dei campi analizzati, è stata ottenuta la percentuale di grado di copertura calcolando la somma della massa batterica (vitale e non vitale) rispetto alla superficie totale del campo ( % di positivi all'interno dell'area totale).