Antiplaque-effect van etherische oliën en 0,2% chloorhexidine op een in situ-model van orale biofilmgroei.

De vrijwilligers droegen twee individuele spalk die in staat was om 6 glazen schijven vast te houden (6 mm in diameter, 1 mm dik); dit werd gepolijst met korrel 800. . Deze spalken bestaan ​​uit 2 vellen, een inwendig vel van zacht vinyl van 1 mm waar de tussenwervelschijven aan vastzitten en een uitwendig stevig vel van 1 mm gemaakt van polyethyleentereftalaat dat is gefenestreerd.

• Mondspoelprotocol Gedurende de duur van 96 uur (4 dagen) van elke studiekuur droeg elke vrijwilliger de spalken met de glazen schijven, en haalde ze alleen tijdens de maaltijden uit de mondholte (ze werden bewaard in een ondoorzichtige container in vochtige omstandigheden) en om mondhygiëneprocedures uit te voeren, waarbij alleen de mechanische verwijdering van bacteriële tandplak met water wordt gebruikt, zonder het gebruik van tandpasta of mondwater.

Met de toegestane mechanische mondhygiënemaatregelen (zonder de spalken) voerden de vrijwilligers de volgende protocollen uit op basis van de instructies van de fabrikant, met de spalken in de mondholte, gedurende de 4 dagen 's ochtends (8.30 uur) na het ontbijt en 's nachts ( 22.00 uur) na het diner:

A) 20 ml spoelingen gedurende 30 seconden met essentiële oliën/2 keer per dag. ----14 dagen---- B) 10 ml spoelingen gedurende 30 seconden met 0,2% chloorhexidine/2 maal daags. ----14 dagen---- C) 20 ml spoelingen gedurende 30 seconden met steriel water (negatieve controle). Met behulp van een op internet gebaseerd, gebalanceerd randomisatiesysteem, dat aangeeft welk mondwater elke proefpersoon als eerste, tweede en derde zou gebruiken, voerden alle vrijwilligers de 3 spoelcycli uit, met een rustperiode van 14 dagen tussen elke test.

• Verzameling van de monsters van Plaque like-biofilm De monsterverzameling gebeurde individueel om 8 uur 's ochtends, zodat de monsters van elke vrijwilliger op verschillende dagen werden geanalyseerd. Er werd vastgesteld dat er minimaal 10 uur had moeten verstrijken sinds het laatste mondwater van de vorige nacht.

Toen de glazen schijven van de spalk werden verwijderd, werden ze onmiddellijk ondergedompeld in 100 µL fluorescentieoplossing LIVE/DEAD® BacLight™ en 15 minuten in een donkere kamer bij kamertemperatuur bewaard. Microscopische observatie werd uitgevoerd door een enkele onderzoeker die niet op de hoogte was van het onderzoeksontwerp, met behulp van een Leica TCS SP2 laser scanning spectrale confocale microscoop (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Duitsland) met een HCX APOL 63x/0.9 lens voor onderdompeling in water.

• Verwerking van de samples van Plaque-like-Biofilm Vier geselecteerde velden of XYZ-reeksen in het centrale deel van elke schijf werden geëvalueerd. Deze velden werden na algemeen onderzoek door de waarnemer als representatief beschouwd voor de hele steekproef. Fluorescentie-emissie werd bepaald in een reeks XY-beelden waarin elk beeld overeenkwam met elk van de Z-posities (diepte). De optische secties werden gescand in secties van 1 µm vanaf het oppervlak van de biofilm tot aan de basis, waarbij de maximale dikte van het veld werd gemeten en vervolgens de gemiddelde dikte van de biofilm van het overeenkomstige monster. De maximale dikte van het biofilmveld werd gedefinieerd als de afstand tussen het substraat (loodrecht) en de toppen van de hoogste celclusters. De maximale biofilmdikte van elk veld werd verdeeld in 3 zones of equivalente lagen: buitenste laag (laag 1), middelste laag (laag 2) en binnenste laag (laag 3).

Het vastleggen van de gegevens gebeurde in alle gevallen met dezelfde instellingen. De ruimtelijke scanmodus (XYZ) en de resolutie van het scanformaat van 1024x1024 pixels werden gebruikt. De argon-ion- en DPSS-laser werden gebruikt met respectievelijk 13% en 78% van de maximale intensiteit. De waarden voor de pinhole, zoom en scansnelheid waren respectievelijk 121,58 micron, 1 en 400 Hz. De enige waarden die verschilden, afhankelijk van het monster, waren de offset (bereik tussen -1% tot 1%) en PMT-versterking, die verschillend was voor kanaal rood en groen, in het algemeen hoger voor groen dan voor rood (test en positief). controle), vanwege het feit dat er meer groen dan rood signaal aanwezig was, terwijl dit voor de negatieve controle het tegenovergestelde was. Deze waarden werden altijd aangepast om een ​​opname van goede kwaliteit te krijgen zonder achtergrondruis, waarbij overmatige verzadiging van de helderste pixels van het beeld werd vermeden. Omdat de technicus blind was voor het experiment, kregen ze het advies om de aanpassingen altijd consistent te maken met wat het objectief van de microscoop zag, om een ​​beeld te verkrijgen dat de werkelijkheid zo dicht mogelijk benaderde.

Kwantificering van bacteriële vitaliteit in de reeks XY-beelden werd bepaald met behulp van cytofluorografische analyse (Leica Confocal Software). In deze analyse werden de beelden van elk fluorochroom gedefinieerd als "kanalen" (SYTO 9 bezet het groene kanaal en propidiumjodide het rode kanaal). Vierkante capture-maskers werden gebruikt om het door de pixels in elk kanaal ingenomen gebied (µm2) te meten, het totale gebied dat door de biofilm wordt ingenomen en het overeenkomstige percentage vitaliteit te bepalen. De intensiteitsbereiken die als positief signaal werden beschouwd, lagen tussen 100 en 255. Bepaling van het gemiddelde percentage bacteriële vitaliteit in elk veld vereiste secties met een biofilmoppervlak van minimaal 250 µm2, en het gemiddelde percentage bacteriële vitaliteit van de biofilm werd berekend voor het overeenkomstige monster en voor elke biofilmlaag.

Voor kwantificering van het percentage oppervlaktesubstraat bedekt door de biofilm (dekkingsgraad), werd het cytofluorogram zelf gebruikt. Uit de maximale projectie (superpositie van alle vastgelegde vlakken) van elk van de geanalyseerde velden werd het percentage dekkingsgraad verkregen door de som van de bacteriemassa (vitaal en niet-vitaal) te berekenen met betrekking tot het totale oppervlak van het veld ( % positief binnen het totale gebied).