Eteeristen öljyjen ja 0,2 % klooriheksidiinin plakkia estävä vaikutus suun biofilmin kasvun in situ -malliin.

Vapaaehtoiset käyttivät kahta yksilöllistä lastaa, jotka pystyivät pitämään 6 lasilevyä (halkaisijaltaan 6 mm, paksuus 1 mm); tämä kiillotettiin 800 karkeudella. . Nämä lastat on muodostettu kahdesta levystä, sisäpuolisesta 1 mm:n pehmeästä vinyylilevystä, johon levyt on kiinnitetty, ja ulkoisesta 1 mm:n jäykästä polyeteenitereftalaatista, joka on reunustettu.

• Suuhuuhtelumenetelmä Kunkin tutkimusjakson 96 tunnin (4 vuorokauden) keston aikana jokainen vapaaehtoinen käytti lastat lasilevyjen kanssa ja vei ne suuontelosta vain aterioiden aikana (ne säilytettiin läpinäkymättömässä astiassa kosteissa olosuhteissa) ja suuhygieniatoimenpiteiden suorittaminen käyttämällä vain bakteeriplakin mekaanista poistoa vedellä, ilman hammastahnaa tai suuvettä.

Vapaaehtoiset suorittivat sallittuja mekaanisia suuhygieniatoimenpiteitä käyttäen (ilman lastoja) seuraavat toimenpiteet valmistajan ohjeiden mukaan lastat suuontelossa 4 päivän ajan aamulla (8.30) aamiaisen jälkeen ja yöllä ( 22.00) illallisen jälkeen:

A) 20 ml huuhtelee 30 sekunnin ajan eteerisillä öljyillä/2 kertaa päivässä. ----14 päivää---- B) 10 ml huuhdellaan 30 sekunnin ajan 0,2 % klooriheksidiinillä/2 kertaa päivässä. ----14 päivää---- C) 20 ml huuhdellaan 30 sekunnin ajan steriilillä vedellä (negatiivinen kontrolli). Käyttämällä Internet-pohjaista tasapainotettua satunnaistusjärjestelmää, joka osoitti suuveden, jota kukin koehenkilö käyttäisi ensin, toiseksi ja kolmanneksi, kaikki vapaaehtoiset suorittivat 3 huuhtelusykliä, ja jokaisen testin välillä oli 14 päivän lepoaika.

• Plaque like-biofilm -näytteiden keräys Näytteenotto tehtiin yksittäin aamulla klo 8, jolloin jokaisen vapaaehtoisen näytteet analysoitiin eri päivinä. Todettiin, että edellisen yön viimeisestä suuvedestä olisi pitänyt kulua vähintään 10 tuntia.

Kun lasikiekot poistettiin lastasta, ne upotettiin välittömästi 100 ul:aan fluoresenssiliuosta LIVE/DEAD® BacLight™ ja pidettiin pimeässä kammiossa huoneenlämpötilassa 15 minuuttia. Mikroskooppisen havainnon suoritti yksi tutkija, joka ei tiennyt tutkimuksen suunnittelusta, käyttäen Leica TCS SP2 laserpyyhkäisyspektrikonfokaalimikroskooppia (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Saksa) ja HCX APOL 63x/0.9 vesiimmersiiviset linssit.

• Plaque like-Biofilm -näytteiden käsittely Neljä valittua kenttää tai XYZ-sarja kunkin levyn keskiosassa arvioitiin. Nämä kentät katsottiin edustaviksi koko otoksesta tarkkailijan yleisen tutkimuksen jälkeen. Fluoresenssiemissio määritettiin XY-kuvien sarjassa, jossa jokainen kuva vastasi kutakin Z-asemaa (syvyys). Optiset leikkeet skannattiin 1 µm:n osissa biofilmin pinnasta sen pohjalle mittaamalla kentän maksimipaksuus ja sen jälkeen vastaavan näytteen biofilmin keskipaksuus. Biofilmikentän maksimipaksuus määriteltiin substraatin (suoraan) ja korkeimpien soluklusterien huippujen väliseksi etäisyydeksi. Kunkin kentän maksimi biokalvon paksuus jaettiin 3 vyöhykkeeseen tai vastaavaan kerrokseen: ulkokerros (kerros 1), keskikerros (kerros 2) ja sisäkerros (kerros 3).

Tietojen talteenotto tehtiin kaikissa tapauksissa samoilla asetuksilla. Käytettiin spatiaalista skannaustilaa (XYZ) ja 1024x1024 pikselin skannausformaatin resoluutiota. Argon-ioni-laseria ja DPSS-laseria käytettiin 13 %:n ja 78 %:n maksimiintensiteetillä. Neulanreiän, zoomauksen ja skannausnopeuden arvot olivat 121,58 mikronia, 1 ja 400 Hz. Ainoat arvot, jotka vaihtelivat näytteestä riippuen, olivat offset (vaihteluväli -1 % - 1 %) ja PMT-vahvistus, joka oli erilainen kanavan punaiselle ja vihreälle, mikä oli yleisesti ottaen korkeampi vihreälle kuin punaiselle (testi ja positiivinen). kontrolli), johtuen siitä, että vihreää signaalia oli enemmän kuin punaista, negatiiviselle kontrollille päinvastoin. Näitä arvoja säädettiin aina hyvän kuvanlaadun saamiseksi ilman taustakohinaa, jolloin vältettiin kuvan kirkkaimpien pikselien liiallinen kylläisyys. Koska teknikko oli sokea kokeelle, heitä kehotettiin tekemään säädöt aina sopusoinnussa mikroskoopin objektiivin näkemän kanssa, jotta saatiin kuva, joka oli mahdollisimman lähellä todellisuutta.

Bakteerien elinvoiman kvantifiointi XY-kuvien sarjassa määritettiin käyttämällä sytofluorografista analyysiä (Leica Confocal Software). Tässä analyysissä kunkin fluorokromin kuvat määriteltiin "kanaviksi" (SYTO 9 miehittää vihreän kanavan ja propidiumjodidi punaisen kanavan). Neliömäisiä sieppausmaskeja käytettiin mittaamaan kunkin kanavan pikselien miehittämä pinta-ala (µm2) määrittämällä biofilmin kokonaispinta-ala ja vastaava prosenttiosuus elinvoimaisuudesta. Positiivisena signaalina pidetyt intensiteettialueet olivat välillä 100-255. Bakteerien elinvoimaisuuden keskimääräisen prosenttiosuuden määrittäminen kullakin pellolla vaati leikkeitä, joiden biofilmin pinta-ala oli vähintään 250 µm2, ja biofilmin bakteerien elinvoimaisuuden keskimääräinen prosenttiosuus laskettiin vastaavalle näytteelle ja kullekin biofilmikerrokselle.

Biofilmin peittämän pintasubstraatin prosenttiosuuden kvantifiointiin (peitelaatu) käytettiin itse sytofluorogrammia. Kunkin analysoidun kentän maksimiprojektiosta (kaikkien kaapattujen tasojen superpositiosta) peittoasteen prosenttiosuus saatiin laskemalla bakteerimassan (vitaali ja ei-vitaali) summa kentän kokonaispintaan ( % positiivinen kokonaispinta-alasta).