Efecto antiplaca de aceites esenciales y clorhexidina al 0,2 % en un modelo in situ de crecimiento de biopelícula oral.

Los voluntarios llevaban dos férulas individualizadas que podían sostener 6 discos de vidrio (6 mm de diámetro, 1 mm de espesor); esto fue pulido en grano 800. . Estas férulas están formadas por 2 láminas, una interna de vinilo blando de 1 mm donde se fijan los discos y una externa rígida de tereftalato de polietileno de 1 mm que va fenestrada.

• Protocolo de enjuague bucal Durante las 96 horas (4 días) de duración de cada curso de estudio, cada voluntario usó las férulas con los discos de vidrio, retirándolos de la cavidad oral solo durante las comidas (se almacenaron en un recipiente opaco en condiciones húmedas) y realizar procedimientos de higiene bucal, utilizando únicamente la eliminación mecánica de la placa bacteriana con agua, sin el uso de ningún tipo de pasta dental o enjuague bucal.

Utilizando las medidas de higiene bucal mecánicas permitidas (sin las férulas), los voluntarios realizaron los siguientes protocolos basados ​​en las instrucciones de los fabricantes, con las férulas en la cavidad oral, durante los 4 días por la mañana (8.30 h) después del desayuno y por la noche ( 22.00) después de la cena:

A) Enjuagues de 20 ml durante 30 segundos con aceites esenciales/2 veces al día. ----14 días---- B) Enjuagues de 10 mL durante 30 segundos con clorhexidina al 0,2%/2 veces al día. ----14 días---- C) Enjuagues de 20 mL durante 30 segundos con agua estéril (control negativo). Usando un sistema de aleatorización balanceada basado en Internet, indicando el enjuague bucal que cada sujeto usaría primero, segundo y tercero, todos los voluntarios realizaron los 3 ciclos de enjuague, con un período de descanso de 14 días entre cada prueba.

• Recogida de las muestras de Plaque like-biofilm La recogida de muestras se realizó de forma individual a las 8 de la mañana, de forma que las muestras de cada voluntario se analizaron en días diferentes. Se determinó que debían haber transcurrido un mínimo de 10 horas desde el último enjuague bucal de la noche anterior.

A medida que se retiraban los discos de vidrio de la férula, se sumergieron inmediatamente en 100 µL de solución de fluorescencia LIVE/DEAD® BacLight™ y se mantuvieron en una cámara oscura a temperatura ambiente durante 15 minutos. La observación microscópica fue realizada por un solo investigador que desconocía el diseño del estudio, utilizando un microscopio confocal espectral de barrido láser Leica TCS SP2 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Alemania) con un HCX APOL 63x/0.9 lente de inmersión en agua.

• Procesamiento de las muestras de Plaque like-Biofilm Se evaluaron cuatro campos seleccionados o series XYZ en la parte central de cada disco. Estos campos se consideraron representativos de toda la muestra después del examen general del observador. La emisión de fluorescencia se determinó en una serie de imágenes XY en las que cada imagen correspondía a cada una de las posiciones Z (profundidad). Las secciones ópticas se escanearon en secciones de 1 µm desde la superficie del biofilm hasta su base, midiendo el espesor máximo del campo y posteriormente el espesor medio del biofilm de la muestra correspondiente. El espesor máximo del campo de biopelícula se definió como la distancia entre el sustrato (en perpendicular) y los picos de los grupos de células más altos. El espesor máximo de biopelícula de cada campo se dividió en 3 zonas o capas equivalentes: capa externa (capa 1), capa intermedia (capa 2) y capa interna (capa 3).

La captura de los datos se realizó con la misma configuración en todos los casos. Se utilizó el modo de escaneo espacial (XYZ) y la resolución de formato de escaneo de 1024x1024 píxeles. Se utilizaron los láseres Argon-ion y DPSS al 13% y 78% de intensidad máxima, respectivamente. Los valores de estenopeica, zoom y velocidad de barrido fueron 121,58 micras, 1 y 400 Hz, respectivamente. Los únicos valores que fueron diferentes dependiendo de la muestra fueron el offset (rango entre -1% a 1%) y la ganancia de PMT que fue diferente para el canal rojo y el verde, siendo en términos generales, mayor para el verde que para el rojo (test y positivo). control), debido a que hubo más presencia de señal verde que roja, siendo para el control negativo todo lo contrario. Estos valores se ajustaron siempre para conseguir una captura de buena calidad sin ruido de fondo, evitando una saturación excesiva de los píxeles más brillantes de la imagen. Como el técnico era ciego al experimento, se le aconsejó que hiciera los ajustes siempre de acuerdo con lo que estaba viendo el objetivo del microscopio, obteniendo una imagen lo más cercana posible a la realidad.

La cuantificación de la vitalidad bacteriana en la serie de imágenes XY se determinó mediante análisis citofluorográfico (Leica Confocal Software). En este análisis, las imágenes de cada fluorocromo se definieron como "canales" (SYTO 9 ocupa el canal verde y el yoduro de propidio el canal rojo). Se utilizaron máscaras de captura cuadradas para medir el área ocupada (µm2) por los píxeles en cada canal, determinando el área total ocupada por el biofilm y el porcentaje de vitalidad correspondiente. Los rangos de intensidad que se consideraron como señal positiva estuvieron entre 100 y 255. La determinación del porcentaje medio de vitalidad bacteriana en cada campo requirió secciones con un área mínima de biofilm de 250 µm2, y se calculó el porcentaje medio de vitalidad bacteriana del biofilm para la muestra correspondiente y para cada capa de biofilm.

Para la cuantificación del porcentaje de sustrato superficial cubierto por el biofilm (grado de cobertura), se utilizó el propio citofluorograma. A partir de la proyección máxima (superposición de todos los planos capturados) de cada uno de los campos analizados, se obtuvo el porcentaje de grado de cobertura calculando la suma de la masa bacteriana (vital y no vital) respecto a la superficie total del campo ( % positivo dentro del área total).