Działanie przeciwpłytkowe olejków eterycznych i 0,2% chlorheksydyny na model in situ wzrostu biofilmu w jamie ustnej.

Ochotnicy nosili dwie indywidualne szyny, które były w stanie pomieścić 6 szklanych krążków (o średnicy 6 mm i grubości 1 mm); to zostało wypolerowane na gradacji 800. . Szyny te składają się z 2 arkuszy, wewnętrznego arkusza miękkiego winylu o grubości 1 mm, do którego przymocowane są krążki, oraz zewnętrznego sztywnego arkusza o grubości 1 mm wykonanego z politereftalanu etylenu z okienkami.

• Protokół płukania jamy ustnej W ciągu 96 godzin (4 dni) każdego cyklu badań każdy ochotnik nosił szyny ze szklanymi krążkami, wyjmując je z jamy ustnej tylko podczas posiłków (przechowywane były w nieprzezroczystym pojemniku w wilgotnych warunkach) oraz wykonywania zabiegów higieny jamy ustnej, polegających wyłącznie na mechanicznym usuwaniu płytki bakteryjnej wodą, bez użycia pasty do zębów i płynów do płukania jamy ustnej.

Stosując dozwolone mechaniczne środki higieny jamy ustnej (bez szyn), ochotnicy wykonywali następujące protokoły na podstawie zaleceń producentów, z szynami w jamie ustnej, przez 4 dni rano (8.30) po śniadaniu i wieczorem ( 22.00) po kolacji:

A) 20 ml płukanek olejkami eterycznymi przez 30 sekund / 2 razy dziennie. ----14 dni---- B) 10 ml płukania przez 30 sekund 0,2% chlorheksydyną/2 razy dziennie. ----14 dni---- C) 20 ml płukania przez 30 sekund sterylną wodą (kontrola negatywna). Korzystając z internetowego systemu zrównoważonej randomizacji, wskazując płyn do płukania jamy ustnej, który każdy badany użyłby jako pierwszy, drugi i trzeci, wszyscy ochotnicy wykonali 3 cykle płukania, z 14-dniową przerwą między każdym testem.

• Pobieranie próbek biofilmu podobnego do płytki nazębnej Pobieranie próbek odbywało się indywidualnie o godzinie 8 rano, tak aby próbki każdego ochotnika analizowano w różne dni. Ustalono, że od ostatniego płukania jamy ustnej poprzedniej nocy powinno upłynąć co najmniej 10 godzin.

Po wyjęciu szklanych krążków z szyny natychmiast zanurzono je w 100 µl roztworu fluorescencyjnego LIVE/DEAD® BacLight™ i trzymano w ciemnej komorze w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Obserwacja mikroskopowa została przeprowadzona przez jednego badacza, który nie był świadomy projektu badania, przy użyciu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP2 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Niemcy) z HCX APOL 63x/0,9 soczewka immersyjna.

• Obróbka próbek biofilmu płytki nazębnej Oceniono cztery wybrane pola lub serie XYZ w centralnej części każdego krążka. Pola te uznano za reprezentatywne dla całej próby po ogólnym badaniu obserwatora. Emisję fluorescencji określono w serii obrazów XY, w których każdy obraz odpowiadał każdej z pozycji Z (głębokość). Przekroje optyczne skanowano w odcinkach 1 µm od powierzchni biofilmu do jego podstawy, mierząc maksymalną grubość pola, a następnie średnią grubość biofilmu odpowiedniej próbki. Maksymalną grubość pola biofilmu zdefiniowano jako odległość między podłożem (w pionie) a szczytami najwyższych skupisk komórek. Maksymalna grubość biofilmu każdego pola została podzielona na 3 strefy lub równoważne warstwy: warstwę zewnętrzną (warstwa 1), warstwę środkową (warstwa 2) i warstwę wewnętrzną (warstwa 3).

Przechwytywanie danych odbywało się przy tych samych ustawieniach we wszystkich przypadkach. Zastosowano tryb skanowania przestrzennego (XYZ) i rozdzielczość formatu skanowania 1024x1024 pikseli. Zastosowano laser argonowo-jonowy i DPSS przy odpowiednio 13% i 78% maksymalnej intensywności. Wartości dla otworka, zoomu i prędkości skanowania wyniosły odpowiednio 121,58 mikrona, 1 i 400 Hz. Jedynymi wartościami, które różniły się w zależności od próbki, było przesunięcie (zakres od -1% do 1%) oraz wzmocnienie PMT, które było różne dla kanału czerwonego i zielonego, będąc generalnie wyższe dla zielonego niż dla czerwonego (testowy i dodatni kontrolna), ze względu na większą obecność sygnału zielonego niż czerwonego, podczas gdy dla kontroli negatywnej było odwrotnie. Wartości te były zawsze dostosowywane, aby uzyskać dobrą jakość przechwytywania bez szumów tła, unikając nadmiernego nasycenia najjaśniejszych pikseli obrazu. Ponieważ technik był ślepy na eksperyment, poradzono mu, aby dokonywał korekt zawsze zgodnych z tym, co widzi obiektyw mikroskopu, uzyskując obraz jak najbardziej zbliżony do rzeczywistości.

Kwantyfikacja żywotności bakterii w serii obrazów XY została określona przy użyciu analizy cytofluorograficznej (Leica Confocal Software). W tej analizie obrazy każdego fluorochromu zdefiniowano jako „kanały” (SYTO 9 zajmuje kanał zielony, a jodek propidyny kanał czerwony). Kwadratowe maski przechwytywania zastosowano do pomiaru obszaru zajmowanego (µm2) przez piksele w każdym kanale, określając całkowity obszar zajmowany przez biofilm i odpowiadający mu procent żywotności. Zakresy intensywności, które uznano za sygnał dodatni, mieściły się w przedziale od 100 do 255. Określenie średniego procentu żywotności bakterii na każdym polu wymagało przekrojów o minimalnej powierzchni biofilmu 250 µm2, a średni procent żywotności biofilmu obliczono dla odpowiedniej próbki i dla każdej warstwy biofilmu.

Do ilościowego określenia procentu podłoża powierzchniowego pokrytego biofilmem (stopień pokrycia) wykorzystano sam cytofluorogram. Z maksymalnego rzutu (superpozycja wszystkich uchwyconych płaszczyzn) każdego z analizowanych pól uzyskano procent stopnia pokrycia obliczając sumę masy bakterii (żywych i martwych) w odniesieniu do całkowitej powierzchni pola ( % dodatnich na całym obszarze).