Effet antiplaque des huiles essentielles et de la chlorhexidine à 0,2 % sur un modèle in situ de croissance du biofilm oral.

Les volontaires portaient deux attelles individualisées pouvant contenir 6 disques de verre (6 mm de diamètre, 1 mm d'épaisseur) ; cela a été poli au grain 800. . Ces attelles sont formées de 2 feuilles, une feuille interne en vinyle souple de 1 mm où sont fixés les disques et une externe rigide de 1 mm en polyéthylène téréphtalate qui est fenestrée.

• Protocole de bain de bouche Pendant la durée de 96 heures (4 jours) de chaque cycle d'étude, chaque volontaire portait les attelles avec les disques de verre, les retirant de la cavité buccale uniquement pendant les repas (elles étaient stockées dans un récipient opaque dans des conditions humides) et pour effectuer des procédures d'hygiène bucco-dentaire, en utilisant uniquement l'élimination mécanique de la plaque bactérienne avec de l'eau, sans utiliser de dentifrice ou de rince-bouche.

En utilisant les mesures d'hygiène bucco-dentaire mécaniques autorisées (sans les attelles), les volontaires ont effectué les protocoles suivants basés sur les instructions des fabricants, avec les attelles dans la cavité buccale, pendant les 4 jours le matin (8h30) après le petit déjeuner et la nuit ( 22h00) après le dîner :

A) 20 ml de rinçage pendant 30 secondes avec des huiles essentielles/2 fois par jour. ----14 jours---- B) 10 mL rincent pendant 30 secondes avec 0,2 % de chlorhexidine/2 fois par jour. ----14 jours---- C) 20 mL rincent pendant 30 secondes avec de l'eau stérile (témoin négatif). À l'aide d'un système de randomisation équilibrée basé sur Internet, indiquant le rince-bouche que chaque sujet utiliserait en premier, deuxième et troisième, tous les volontaires ont effectué les 3 cycles de rinçage, avec une période de repos de 14 jours entre chaque test.

• Collecte des échantillons de Plaque like-biofilm La collecte des échantillons a été effectuée individuellement à 8 heures du matin, de sorte que les échantillons de chaque volontaire ont été analysés à des jours différents. Il a été déterminé qu'un minimum de 10 heures aurait dû s'écouler depuis le dernier bain de bouche de la nuit précédente.

Lorsque les disques de verre ont été retirés de l'attelle, ils ont été immédiatement immergés dans 100 µL de solution de fluorescence LIVE/DEAD® BacLight™ et conservés dans une chambre noire à température ambiante pendant 15 minutes. L'observation microscopique a été réalisée par un seul chercheur qui n'était pas au courant de la conception de l'étude, à l'aide d'un microscope confocal spectral à balayage laser Leica TCS SP2 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Allemagne) avec un HCX APOL 63x/0,9 lentille à immersion dans l'eau.

• Traitement des échantillons de Plaque like-Biofilm Quatre champs sélectionnés ou séries XYZ dans la partie centrale de chaque disque ont été évalués. Ces champs ont été considérés comme représentatifs de l'ensemble de l'échantillon après l'examen général de l'observateur. L'émission de fluorescence a été déterminée dans une série d'images XY dans lesquelles chaque image correspondait à chacune des positions Z (profondeur). Les coupes optiques ont été scannées en coupes de 1 µm depuis la surface du biofilm jusqu'à sa base, en mesurant l'épaisseur maximale du champ puis l'épaisseur moyenne du biofilm de l'échantillon correspondant. L'épaisseur maximale du champ de biofilm a été définie comme la distance entre le substrat (en perpendiculaire) et les pics des amas cellulaires les plus élevés. L'épaisseur maximale du biofilm de chaque champ a été divisée en 3 zones ou couches équivalentes : couche externe (couche 1), couche médiane (couche 2) et couche interne (couche 3).

La saisie des données a été effectuée avec les mêmes paramètres dans tous les cas. Le mode de balayage spatial (XYZ) et la résolution du format de balayage de 1024x1024 pixels ont été utilisés. Les lasers Argon-ion et DPSS ont été utilisés à 13 % et 78 % de l'intensité maximale, respectivement. Les valeurs pour le sténopé, le zoom et la vitesse de balayage étaient respectivement de 121,58 microns, 1 et 400 Hz. Les seules valeurs différentes selon les échantillons étaient l'offset (plage de -1% à 1%) et le gain PMT qui était différent pour le canal rouge et vert, étant en général plus élevé pour le vert que pour le rouge (test et positif). contrôle), en raison du fait qu'il y avait plus de présence de signal vert que rouge, étant pour le contrôle négatif le contraire. Ces valeurs ont toujours été ajustées pour obtenir une capture de bonne qualité sans bruit de fond, en évitant une saturation excessive des pixels les plus brillants de l'image. Comme le technicien était aveugle à l'expérience, il lui a été conseillé de faire les réglages toujours cohérents avec ce que voyait l'objectif du microscope, en obtenant une image la plus proche possible de la réalité.

La quantification de la vitalité bactérienne dans la série d'images XY a été déterminée à l'aide d'une analyse cytofluorographique (Leica Confocal Software). Dans cette analyse, les images de chaque fluorochrome ont été définies comme des "canaux" (le SYTO 9 occupe le canal vert et l'iodure de propidium le canal rouge). Des masques de capture carrés ont été utilisés pour mesurer la surface occupée (µm2) par les pixels dans chaque canal, en déterminant la surface totale occupée par le biofilm et le pourcentage de vitalité correspondant. Les plages d'intensité considérées comme un signal positif étaient comprises entre 100 et 255. La détermination du pourcentage moyen de vitalité bactérienne dans chaque champ nécessitait des sections avec une surface minimale de biofilm de 250 µm2, et le pourcentage moyen de vitalité bactérienne du biofilm était calculé pour l'échantillon correspondant et pour chaque couche de biofilm.

Pour la quantification du pourcentage de substrat de surface recouvert par le biofilm (degré de couverture), le cytofluorogramme lui-même a été utilisé. A partir de la projection maximale (superposition de tous les plans capturés) de chacun des champs analysés, le pourcentage de degré de recouvrement a été obtenu en calculant la somme de la masse bactérienne (vivante et non vitale) par rapport à la surface totale du champ ( % positif dans la zone totale).