Antiplakový účinek esenciálních olejů a 0,2% chlorhexidinu na in situ model růstu orálního biofilmu.

Dobrovolníci nosili dvě individualizované dlahy, které byly schopné držet 6 skleněných kotoučů (průměr 6 mm, tloušťka 1 mm); toto bylo leštěno na zrnitost 800. . Tyto dlahy jsou tvořeny 2 listy, vnitřní 1 mm měkkou vinylovou fólií, kde jsou připevněny disky, a vnější 1 mm pevnou fólií vyrobenou z polyetylen tereftalátu, která je perforovaná.

• Protokol ústní vody Během 96 hodin (4 dnů) trvání každého cyklu studie každý dobrovolník nosil dlahy se skleněnými disky a vytahoval je z ústní dutiny pouze během jídla (byly skladovány v neprůhledné nádobě ve vlhkém prostředí) a provádět procedury ústní hygieny pouze za použití mechanického odstranění bakteriálního plaku vodou, bez použití jakékoli zubní pasty nebo ústní vody.

Za použití povolených opatření mechanické ústní hygieny (bez dlah) dobrovolníci prováděli následující protokoly na základě pokynů výrobců s dlahami v dutině ústní po dobu 4 dnů ráno (8.30) po snídani a v noci ( 22:00) po večeři:

A) 20 ml máchání po dobu 30 sekund s esenciálními oleji/2krát denně. ----14 dní---- B) 10 ml proplachování po dobu 30 sekund 0,2% chlorhexidinem/2krát denně. ----14 dní---- C) 20 ml proplachů po dobu 30 sekund sterilní vodou (negativní kontrola). Pomocí internetového vyváženého randomizačního systému s uvedením ústní vody, kterou by každý subjekt použil jako první, druhý a třetí, provedli všichni dobrovolníci 3 cykly vyplachování s přestávkou 14 dní mezi každým testem.

• Odběr vzorků Plaque like-biofilm Odběr vzorků byl prováděn individuálně v 8 hodin ráno, takže vzorky každého dobrovolníka byly analyzovány v různé dny. Bylo stanoveno, že od poslední ústní vody předchozí noci mělo uplynout minimálně 10 hodin.

Když byly skleněné disky odstraněny z dlahy, byly okamžitě ponořeny do 100 ul fluorescenčního roztoku LIVE/DEAD® BacLight™ a udržovány v tmavé komoře při pokojové teplotě po dobu 15 minut. Mikroskopické pozorování provedl jediný výzkumník, který neznal design studie, pomocí laserového skenovacího spektrálního konfokálního mikroskopu Leica TCS SP2 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Německo) s HCX APOL 63x/0,9 čočka ponořená do vody.

• Zpracování vzorků Plaque like-Biofilm Byla hodnocena čtyři vybraná pole nebo série XYZ ve střední části každého disku. Tato pole byla po celkovém zkoumání pozorovatelem považována za reprezentativní pro celý vzorek. Fluorescenční emise byla stanovena v sérii XY snímků, ve kterých každý snímek odpovídal každé z poloh Z (hloubka). Optické řezy byly skenovány v 1 um řezech od povrchu biofilmu k jeho základně, přičemž byla změřena maximální tloušťka pole a následně střední tloušťka biofilmu odpovídajícího vzorku. Maximální tloušťka pole biofilmu byla definována jako vzdálenost mezi substrátem (v kolmici) a vrcholy nejvyšších buněčných shluků. Maximální tloušťka biofilmu každého pole byla rozdělena do 3 zón nebo ekvivalentních vrstev: vnější vrstva (vrstva 1), střední vrstva (vrstva 2) a vnitřní vrstva (vrstva 3).

Sběr dat byl ve všech případech proveden se stejným nastavením. Byl použit režim prostorového skenování (XYZ) a rozlišení skenovacího formátu 1024x1024 pixelů. Argon-iontový laser a DPSS laser byly použity s maximální intenzitou 13 %, respektive 78 %. Hodnoty pro dírku, zoom a rychlost skenování byly 121,58 mikronů, 1 a 400 Hz, v tomto pořadí. Jediné hodnoty, které se lišily v závislosti na vzorku, byly offset (rozsah mezi -1 % až 1 %) a zisk PMT, který se lišil pro kanál červený a zelený, přičemž obecně byl vyšší pro zelenou než pro červenou (test a pozitivní kontrola), vzhledem k tomu, že byl více přítomen zelený než červený signál, u negativní kontroly je tomu naopak. Tyto hodnoty byly vždy upraveny tak, aby bylo dosaženo kvalitního zachycení bez šumu na pozadí, aby se zabránilo nadměrné saturaci nejjasnějších pixelů obrazu. Protože technik byl k experimentu slepý, bylo jim doporučeno, aby provedli úpravy vždy v souladu s tím, co viděl objektiv mikroskopu, a získali tak obraz, který se co nejvíce blíží realitě.

Kvantifikace bakteriální vitality v sérii XY snímků byla stanovena pomocí cytofluorografické analýzy (Leica Confocal Software). V této analýze byly obrazy každého fluorochromu definovány jako "kanály" (SYTO 9 zabírá zelený kanál a propidium jodid červený kanál). Čtvercové snímací masky byly použity k měření plochy obsazené (µm2) pixely v každém kanálu, přičemž se určila celková plocha obsazená biofilmem a odpovídající procento vitality. Rozsahy intenzity, které byly považovány za pozitivní signál, byly mezi 100 a 255. Stanovení průměrného procenta bakteriální vitality v každém poli vyžadovalo řezy s minimální plochou biofilmu 250 µm2 a průměrné procento bakteriální vitality biofilmu bylo vypočteno pro odpovídající vzorek a pro každou vrstvu biofilmu.

Pro kvantifikaci procenta povrchového substrátu pokrytého biofilmem (stupeň pokrytí) byl použit samotný cytofluorogram. Z maximální projekce (superpozice všech zachycených rovin) každého z analyzovaných polí bylo získáno procento stupně pokrytí výpočtem součtu bakteriální hmoty (vitální a neživotné) vzhledem k celkové ploše pole ( % kladných v rámci celkové plochy).