Az illóolajok és a 0,2%-os klórhexidin plakkellenes hatása az orális biofilm növekedés in situ modelljére.

Az önkéntesek két egyénre szabott sínt viseltek, amely 6 üvegkorongot (6 mm átmérőjű, 1 mm vastag) tudott tartani; ezt 800-as szemcsefinomsággal csiszolták. . Ezek a sínek 2 lapból állnak, egy belső 1 mm-es puha vinil lemezből, amelyhez a korongok vannak rögzítve, és egy külső 1 mm-es merev polietilén-tereftalátból, amely be van zárva.

• Szájöblítési protokoll Az egyes vizsgálati kurzusok 96 órás (4 napos) időtartama alatt minden önkéntes hordta a síneket az üvegkorongokkal, és csak étkezés közben húzta ki a szájüregből (nedves körülmények között átlátszatlan edényben tárolták), és szájhigiénés eljárásokat végezni, kizárólag a bakteriális lepedék vízzel történő mechanikus eltávolításával, fogkrém vagy szájvíz használata nélkül.

Az önkéntesek a megengedett mechanikus szájhigiénés intézkedéseket alkalmazva (sín nélkül) az alábbi protokollokat hajtották végre a gyártó utasításai alapján, a sínekkel a szájüregben, a reggeli 4 napon (8.30) reggeli után és éjszaka ( 22.00) vacsora után:

A) 20 ml öblítés 30 másodpercig illóolajokkal/naponta kétszer. ----14 nap---- B) 10 ml öblítés 30 másodpercig 0,2%-os klórhexidinnel/naponta kétszer. ----14 nap---- C) 20 ml-es öblítés 30 másodpercig steril vízzel (negatív kontroll). Internet-alapú kiegyensúlyozott randomizációs rendszert használva, jelezve, hogy az egyes alanyok milyen szájvizet használnak először, másodikként és harmadikként, minden önkéntes elvégezte a 3 öblítési ciklust, az egyes tesztek között 14 napos pihenőidővel.

• A plakkszerű biofilm mintáinak gyűjtése A mintavétel reggel 8 órakor egyénileg történt, így az egyes önkéntesek mintáit különböző napokon elemeztük. Megállapították, hogy legalább 10 órának el kell telnie az előző esti utolsó szájöblítés óta.

Amint az üvegkorongokat eltávolítottuk a sínről, azonnal 100 µl LIVE/DEAD® BacLight™ fluoreszcens oldatba merítettük, és szobahőmérsékleten sötét kamrában tartottuk 15 percig. A mikroszkópos megfigyelést egyetlen vizsgáló végezte, aki nem volt tisztában a vizsgálat tervével, egy Leica TCS SP2 lézer pásztázó spektrális konfokális mikroszkóppal (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Németország) HCX APOL 63x/0.9 készülékkel. vízbe merülő lencse.

• A Plaque like-Biofilm mintáinak feldolgozása Minden lemez központi részén négy kiválasztott mezőt vagy XYZ sorozatot értékeltünk. Ezeket a mezőket a megfigyelő általános vizsgálata után a teljes mintára reprezentatívnak tekintettük. A fluoreszcencia emissziót XY képek sorozatában határoztuk meg, amelyekben minden kép megfelelt az egyes Z pozícióknak (mélység). Az optikai metszeteket 1 µm-es metszetekben pásztáztuk a biofilm felületétől az aljáig, megmérve a mező maximális vastagságát, majd a megfelelő minta biofilmjének átlagos vastagságát. A biofilm mező maximális vastagságát a szubsztrát (merőlegesen) és a legmagasabb sejtklaszterek csúcsai közötti távolságként határoztuk meg. Az egyes mezők maximális biofilmvastagságát 3 zónára vagy egyenértékű rétegre osztották: külső réteg (1. réteg), középső réteg (2. réteg) és belső réteg (3. réteg).

Az adatok rögzítése minden esetben azonos beállításokkal történt. A térbeli letapogatási módot (XYZ) és az 1024x1024 pixeles szkennelési formátum felbontást használtuk. Az argon-ion lézert és a DPSS lézert a maximális intenzitás 13%-án, illetve 78%-án használták. A tűlyuk, a zoom és a pásztázási sebesség értéke 121,58 mikron, 1 és 400 Hz volt. Az egyetlen érték, amely a mintától függően különbözött, az eltolás (-1% és 1% közötti tartomány) és a PMT-erősítés volt, amely eltérő volt a piros és a zöld csatornánál, általánosságban véve magasabb a zöldnél, mint a pirosnál (teszt és pozitív). kontroll), mivel több volt a zöld, mint a piros jel jelenléte, míg a negatív kontrollnál ennek az ellenkezője. Ezeket az értékeket mindig úgy igazították, hogy jó minőségű, háttérzaj nélküli rögzítést kapjanak, elkerülve a kép legfényesebb képpontjainak túlzott telítettségét. Mivel a technikus vak volt a kísérletre, azt tanácsolták nekik, hogy a beállításokat mindig tegyék összhangban azzal, amit a mikroszkóp objektíve látott, és a valósághoz a lehető legközelebb álló képet kapják.

A bakteriális vitalitás mennyiségi meghatározását az XY képek sorozatában citofluorográfiai analízissel (Leica Confocal Software) határoztuk meg. Ebben az elemzésben minden egyes fluorokróm képét "csatornaként" határoztuk meg (a SYTO 9 a zöld csatornát, a propidium-jodid pedig a vörös csatornát foglalja el). Négyzet alakú rögzítési maszkokat használtunk a pixelek által elfoglalt terület (µm2) mérésére az egyes csatornákban, meghatározva a biofilm által elfoglalt teljes területet és a vitalitás megfelelő százalékát. A pozitív jelnek tekintett intenzitástartományok 100 és 255 között voltak. A bakteriális vitalitás átlagos százalékos meghatározásához minden területen legalább 250 µm2 biofilm területű metszetekre volt szükség, és a megfelelő mintára és minden biofilm rétegre kiszámítottuk a biofilm átlagos százalékos bakteriális vitalitását.

A biofilmmel borított felületi szubsztrát százalékos mennyiségének meghatározásához magát a citofluorogramot használtuk. Az egyes vizsgált mezők maximális vetületéből (az összes befogott sík szuperpozíciójából) a borítási fok százalékát úgy kaptuk meg, hogy kiszámítottuk a baktériumtömeg (létfontosságú és nem életfontosságú) összegét a tábla teljes felületéhez viszonyítva ( % pozitív a teljes területen).