精油和 0.2% 洗必太对口腔生物膜生长原位模型的抗斑作用。

志愿者佩戴两个个性化的夹板，可以固定 6 个玻璃盘（直径 6 毫米，厚度 1 毫米）；这是在 800 砂砾下抛光的。 . 这些夹板由 2 块板组成，一块内部 1 毫米软乙烯基板，用于连接圆盘，另一块外部 1 毫米硬质板，由开窗的聚对苯二甲酸乙二醇酯制成。

• 漱口方案 在每个研究课程的 96 小时（4 天）期间，每个志愿者都佩戴带有玻璃盘的夹板，仅在进餐时将它们从口腔中取出（它们在潮湿条件下储存在不透明容器中）并且执行口腔卫生程序，仅用水机械去除菌斑，不使用任何牙膏或漱口水。

使用允许的机械口腔卫生措施（没有夹板），志愿者根据制造商的说明执行以下方案，在口腔内夹板，在早餐后和晚上的 4 天内（8.30）（ 22.00) 晚餐后：

A) 20 毫升用精油冲洗 30 秒/每天 2 次。 ----14 天---- B) 10 毫升用 0.2% 氯己定冲洗 30 秒/每天 2 次。 ----14 天---- C) 20 mL 用无菌水冲洗 30 秒（阴性对照）。 使用基于互联网的平衡随机化系统，指示每个受试者第一次、第二次和第三次使用的漱口水，所有志愿者执行 3 个漱口周期，每次测试之间有 14 天的休息时间。

• 斑块样生物膜样品的收集 样品收集在早上8 点单独进行，以便在不同的日子分析每个志愿者的样品。 确定自前一晚最后一次漱口后至少应过去 10 小时。

当玻璃圆盘从夹板上取下时，立即将它们浸入 100 µL 荧光溶液 LIVE/DEAD® BacLight™ 中，并在室温下的暗室中放置 15 分钟。 显微镜观察由一位不知道研究设计的研究者使用配备 HCX APOL 63x/0.9 的 Leica TCS SP2 激光扫描光谱共聚焦显微镜（Leica Microsystems Heidelberg GmbH，德国曼海姆）进行 浸水镜头。

• 斑块状生物膜样品的处理 对每个圆盘中央部分的四个选定区域或XYZ 系列进行了评估。 在观察者的一般检查之后，这些视场被认为是整个样本的代表。 在一系列 XY 图像中确定荧光发射，其中每个图像对应于每个 Z 位置（深度）。 光学部分从生物膜表面到其底部扫描 1 µm 部分，测量场的最大厚度，然后测量相应样品的生物膜的平均厚度。 生物膜场的最大厚度定义为基板（垂直）和最高细胞簇的峰之间的距离。 每个区域的最大生物膜厚度分为3个区域或等效层：外层（第1层）、中层（第2层）和内层（​​第3层）。

在所有情况下，数据的捕获都是使用相同的设置完成的。 使用空间扫描模式 (XYZ) 和 1024x1024 像素扫描格式分辨率。 氩离子和 DPSS 激光分别以 13% 和 78% 的最大强度使用。 针孔、变焦和扫描速度的值分别为 121.58 微米、1 和 400Hz。 根据样本不同的唯一值是偏移（范围在 -1% 到 1% 之间）和 PMT 增益，这对于通道红色和绿色是不同的，一般来说，绿色高于红色（测试和正控制），因为绿色信号多于红色信号，对于负控制则相反。 始终调整这些值以获得没有背景噪音的高质量捕获，避免图像最亮像素的过度饱和。 由于技术人员对实验视而不见，因此建议他们进行调整，始终与显微镜物镜所看到的一致，以获得尽可能接近现实的图像。

使用细胞荧光分析 (Leica Confocal Software) 确定 XY 图像系列中细菌活力的量化。 在此分析中，每种荧光染料的图像被定义为“通道”（SYTO 9 占据绿色通道，碘化丙啶占据红色通道）。 方形捕获掩模用于测量每个通道中像素占用的面积 (µm2)，确定生物膜占用的总面积和相应的活力百分比。 被认为是阳性信号的强度范围在 100 到 255 之间。 确定每个区域的平均细菌活力百分比需要生物膜最小面积为 250 µm2 的切片，并计算相应样品和每个生物膜层的生物膜细菌活力平均百分比。

为了量化生物膜覆盖的表面基质的百分比（覆盖等级），使用了细胞荧光图本身。 从每个分析区域的最大投影（捕获的所有平面的叠加），通过计算关于区域总表面的细菌质量（活的和非活的）的总和获得覆盖等级的百分比（总面积内的阳性百分比）。