Efeito antiplaca de óleos essenciais e clorexidina 0,2% em um modelo in situ de crescimento de biofilme oral.

Os voluntários usavam duas talas individualizadas que eram capazes de conter 6 discos de vidro (6 mm de diâmetro, 1 mm de espessura); este foi polido em grão 800. . Essas talas são formadas por 2 folhas, uma interna de vinil macio de 1 mm onde os discos são fixados e outra externa rígida de 1 mm feita de tereftalato de polietileno que é fenestrada.

• Protocolo de bochechos Durante as 96 horas (4 dias) de duração de cada curso de estudo, cada voluntário usou as talas com os discos de vidro, retirando-os da cavidade oral apenas durante as refeições (foram armazenados em um recipiente opaco em condições úmidas) e realizar procedimentos de higiene bucal, utilizando apenas a remoção mecânica da placa bacteriana com água, sem o uso de qualquer creme dental ou enxaguatório bucal.

Usando as medidas mecânicas de higiene bucal permitidas (sem as talas), os voluntários realizaram os seguintes protocolos com base nas instruções dos fabricantes, com as talas na cavidade oral, durante os 4 dias da manhã (8h30) após o café da manhã e à noite ( 22h00) após o jantar:

A) Enxágües de 20 ml por 30 segundos com óleos essenciais/2 vezes ao dia. ----14 dias---- B) Enxágües de 10 mL por 30 segundos com clorexidina 0,2%/2 vezes ao dia. ----14 dias---- C) 20 mL por 30 segundos com água estéril (controle negativo). Usando um sistema de randomização balanceado baseado na internet, indicando o enxaguante bucal que cada sujeito usaria primeiro, segundo e terceiro, todos os voluntários realizaram os 3 ciclos de enxágue, com um período de descanso de 14 dias entre cada teste.

• Coleta das amostras de Plaque like-biofilm A coleta das amostras foi feita individualmente às 8h da manhã, de forma que as amostras de cada voluntário foram analisadas em dias diferentes. Foi determinado que deveria ter transcorrido um mínimo de 10 horas desde o último bochecho na noite anterior.

À medida que os discos de vidro eram removidos da tala, eles eram imediatamente imersos em 100 µL da solução fluorescente LIVE/DEAD® BacLight™ e mantidos em câmara escura à temperatura ambiente por 15 minutos. A observação microscópica foi realizada por um único investigador que desconhecia o desenho do estudo, usando um microscópio confocal espectral de varredura a laser Leica TCS SP2 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Alemanha) com um HCX APOL 63x/0,9 lente de imersão em água.

• Processamento das amostras de Plaque like-Biofilm Quatro campos selecionados ou séries XYZ na parte central de cada disco foram avaliados. Esses campos foram considerados representativos de toda a amostra após o exame geral do observador. A emissão de fluorescência foi determinada em uma série de imagens XY em que cada imagem correspondia a cada uma das posições Z (profundidade). Os cortes ópticos foram escaneados em cortes de 1 µm desde a superfície do biofilme até sua base, medindo-se a espessura máxima do campo e posteriormente a espessura média do biofilme da amostra correspondente. A espessura máxima do campo de biofilme foi definida como a distância entre o substrato (na perpendicular) e os picos dos aglomerados celulares mais altos. A espessura máxima do biofilme de cada campo foi dividida em 3 zonas ou camadas equivalentes: camada externa (camada 1), camada intermediária (camada 2) e camada interna (camada 3).

A captura dos dados foi feita com as mesmas configurações em todos os casos. O modo de varredura espacial (XYZ) e a resolução do formato de varredura de 1024x1024 pixels foram usados. O laser de íons de argônio e DPSS foram usados ​​em 13% e 78% da intensidade máxima, respectivamente. Os valores para pinhole, zoom e velocidade de varredura foram 121,58 mícrons, 1 e 400 Hz, respectivamente. Os únicos valores diferentes dependendo da amostra foram o offset (intervalo entre -1% a 1%) e o ganho PMT que foi diferente para canal vermelho e verde, sendo em termos gerais, maior para verde do que para vermelho (teste e positivo controle), devido ao fato de haver mais presença de sinal verde do que vermelho, sendo para o controle negativo o contrário. Esses valores foram sempre ajustados para obter uma captura de boa qualidade sem ruído de fundo, evitando a saturação excessiva dos pixels mais claros da imagem. Como o técnico era cego para o experimento, foi orientado a fazer os ajustes sempre condizentes com o que estava sendo visto pela objetiva do microscópio, obtendo uma imagem o mais próximo possível da realidade.

A quantificação da vitalidade bacteriana na série de imagens XY foi determinada por análise citofluorográfica (Leica Confocal Software). Nesta análise, as imagens de cada fluorocromo foram definidas como "canais" (o SYTO 9 ocupa o canal verde e o iodeto de propídio o canal vermelho). Máscaras de captura quadradas foram usadas para medir a área ocupada (µm2) pelos pixels em cada canal, determinando a área total ocupada pelo biofilme e o percentual de vitalidade correspondente. As faixas de intensidade que foram consideradas como sinal positivo foram entre 100 e 255. A determinação do percentual médio de vitalidade bacteriana em cada campo exigiu cortes com área mínima de biofilme de 250 µm2, sendo calculado o percentual médio de vitalidade bacteriana do biofilme para a amostra correspondente e para cada camada de biofilme.

Para quantificação da porcentagem de superfície do substrato recoberta pelo biofilme (covering grade), foi utilizado o próprio citofluorograma. A partir da projeção máxima (sobreposição de todos os planos capturados) de cada um dos campos analisados, obteve-se o percentual de grau de recobrimento, calculando-se a soma da massa bacteriana (vital e não vital) em relação à superfície total do campo ( % positivo dentro da área total).