Противозубный эффект эфирных масел и 0,2% хлоргексидина на модели роста биопленки полости рта in situ.

Добровольцы носили две индивидуальные шины, способные удерживать 6 стеклянных дисков (диаметром 6 мм, толщиной 1 мм); это было отполировано с зернистостью 800. . Эти шины состоят из 2 листов: внутреннего мягкого винилового листа толщиной 1 мм, к которому прикреплены диски, и внешнего жесткого листа толщиной 1 мм из полиэтилентерефталата с отверстиями.

• Протокол полоскания рта. В течение 96 часов (4 дня) каждого курса исследования каждый доброволец носил шины со стеклянными дисками, извлекая их из полости рта только во время еды (они хранились в непрозрачном контейнере во влажных условиях) и проводить гигиенические процедуры полости рта, используя только механическое удаление бактериального налета водой, без применения каких-либо зубных паст или ополаскивателей.

Используя разрешенные механические средства гигиены полости рта (без шин), добровольцы выполняли следующие протоколы, основанные на инструкциях производителей, с шинами в полости рта в течение 4 дней утром (8.30) после завтрака и ночью ( 22.00) после ужина:

А) 20 мл ополаскивателей в течение 30 секунд с эфирными маслами/2 раза в день. ----14 дней---- B) 10 мл полосканий в течение 30 секунд 0,2% раствором хлоргексидина/2 раза в день. ----14 дней---- C) 20 мл ополаскивают в течение 30 секунд стерильной водой (отрицательный контроль). Используя сбалансированную систему рандомизации в Интернете, указывающую, какую жидкость для полоскания рта каждый субъект будет использовать первым, вторым и третьим, все добровольцы выполнили 3 цикла полоскания с периодом отдыха 14 дней между каждым тестом.

• Сбор образцов бляшковидной биопленки Сбор образцов проводился индивидуально в 8 часов утра, так что образцы каждого добровольца анализировались в разные дни. Было установлено, что с момента последнего полоскания рта накануне вечером должно пройти не менее 10 часов.

После снятия стеклянных дисков с шины их немедленно погружали в 100 мкл флуоресцентного раствора LIVE/DEAD® BacLight™ и выдерживали в темной камере при комнатной температуре в течение 15 минут. Микроскопическое наблюдение проводилось одним исследователем, который не знал о плане исследования, с использованием лазерного сканирующего спектрального конфокального микроскопа Leica TCS SP2 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Мангейм, Германия) с HCX APOL 63x/0,9. водоиммерсионный объектив.

• Обработка образцов бляшкоподобной биопленки. Были оценены четыре выбранных поля или серии XYZ в центральной части каждого диска. Эти поля считались репрезентативными для всей выборки после общего осмотра наблюдателем. Испускание флуоресценции определяли в серии изображений XY, в которых каждое изображение соответствовало каждой из позиций Z (глубина). Оптические срезы сканировали в срезах толщиной 1 мкм от поверхности биопленки до ее основания, измеряя максимальную толщину поля, а затем среднюю толщину биопленки соответствующего образца. Максимальную толщину поля биопленки определяли как расстояние между подложкой (по перпендикуляру) и пиками наиболее высоких скоплений клеток. Максимальная толщина биопленки каждого поля была разделена на 3 зоны или эквивалентные слои: внешний слой (слой 1), средний слой (слой 2) и внутренний слой (слой 3).

Захват данных производился с одинаковыми настройками во всех случаях. Использовался режим пространственного сканирования (XYZ) и разрешение формата сканирования 1024x1024 пикселей. Аргон-ионный и DPSS-лазер использовались при максимальной интенсивности 13% и 78% соответственно. Значения пинхола, масштабирования и скорости сканирования составили 121,58 мкм, 1 и 400 Гц соответственно. Единственными значениями, которые отличались в зависимости от образца, были смещение (диапазон от -1% до 1%) и усиление ФЭУ, которое было разным для красного и зеленого каналов, будучи в целом выше для зеленого, чем для красного (тест и положительный результат). контроль) из-за того, что зеленый сигнал присутствовал больше, чем красный, в то время как для отрицательного контроля было наоборот. Эти значения всегда корректировались, чтобы получить снимок хорошего качества без фонового шума, избегая чрезмерного насыщения самых ярких пикселей изображения. Поскольку техник был слеп к эксперименту, им посоветовали всегда вносить коррективы в соответствии с тем, что видит объектив микроскопа, получая изображение, максимально близкое к реальности.

Количественную оценку жизнеспособности бактерий в серии изображений XY определяли с помощью цитофлюорографического анализа (программное обеспечение Leica Confocal). В этом анализе изображения каждого флуорохрома были определены как «каналы» (SYTO 9 занимает зеленый канал, а иодид пропидия - красный канал). Квадратные маски захвата использовались для измерения площади, занимаемой (мкм2) пикселями в каждом канале, определяя общую площадь, занимаемую биопленкой, и соответствующий процент жизнеспособности. Диапазоны интенсивности, которые считались положительным сигналом, находились между 100 и 255. Для определения среднего процента жизнеспособности бактерий в каждом поле требовались срезы с минимальной площадью биопленки 250 мкм2, а средний процент жизнеспособности бактерий рассчитывали для соответствующего образца и для каждого слоя биопленки.

Для количественного определения процента поверхностного субстрата, покрытого биопленкой (степень покрытия), использовали саму цитофлюорограмму. Из максимальной проекции (суперпозиции всех захваченных плоскостей) каждого из анализируемых полей был получен процент степени покрытия путем расчета суммы бактериальной массы (витальной и неживой) по отношению к общей поверхности поля ( % положительных в пределах общей площади).