Antiplaque-effekt af æteriske olier og 0,2 % klorhexidin på en in situ-model af oral biofilmvækst.

De frivillige bar to individualiserede skinner, som var i stand til at holde 6 glasskiver (6 mm i diameter, 1 mm tykkelse); dette blev poleret ved 800 grit. . Disse skinner er dannet af 2 plader, en indvendig 1 mm blød vinylplade, hvor skiverne er fastgjort, og en udvendig 1 mm stiv, lavet af polyethylenterephtalat, der er fenestreret.

• Mundskylningsprotokol I løbet af 96 timers (4 dage) varighed af hvert studieforløb bar hver frivillig skinnerne med glasskiverne og trak dem kun ud af mundhulen under måltider (de blev opbevaret i en uigennemsigtig beholder under fugtige forhold) og at udføre mundhygiejneprocedurer, kun ved hjælp af mekanisk fjernelse af bakteriel plak med vand, uden brug af tandpasta eller mundskyl.

Ved at bruge de tilladte mekaniske mundhygiejneforanstaltninger (uden skinnerne) udførte de frivillige følgende protokoller baseret på producentens instruktioner, med skinnerne i mundhulen, i løbet af de 4 dage om morgenen (8.30) efter morgenmad og om natten ( 22.00) efter middagen:

A) 20 ml skylles i 30 sekunder med æteriske olier/2 gange dagligt. ----14 dage---- B) 10 ml skylles i 30 sekunder med 0,2 % klorhexidin/2 gange dagligt. ----14 dage---- C) 20 mL skylles i 30 sekunder med sterilt vand (negativ kontrol). Ved at bruge et internetbaseret afbalanceret randomiseringssystem, der angiver den mundskylning, som hver forsøgsperson ville bruge første, anden og tredje, udførte alle frivillige de 3 skyllecyklusser med en hvileperiode på 14 dage mellem hver test.

• Indsamling af prøverne af Plaque-lignende biofilm. Prøvetagningen blev foretaget individuelt kl. 8 om morgenen, således at prøverne fra hver frivillig blev analyseret på forskellige dage. Det blev fastslået, at der skulle være gået minimum 10 timer siden sidste mundskyl den foregående nat.

Da glasskiverne blev fjernet fra skinnen, blev de straks nedsænket i 100 µL fluorescensopløsning LIVE/DEAD® BacLight™ og holdt i et mørkt kammer ved stuetemperatur i 15 minutter. Mikroskopisk observation blev udført af en enkelt efterforsker, som ikke var klar over undersøgelsens design, ved hjælp af et Leica TCS SP2 laserscanning spektralt konfokalmikroskop (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Tyskland) med en HCX APOL 63x/0.9 vand-immersion linse.

• Behandling af prøverne af Plaque-lignende biofilm Fire udvalgte felter eller XYZ-serier i den centrale del af hver disk blev evalueret. Disse felter blev anset for at være repræsentative for hele stikprøven efter observatørens generelle undersøgelse. Fluorescensemission blev bestemt i en serie af XY-billeder, hvor hvert billede svarede til hver af Z-positionerne (dybde). De optiske sektioner blev scannet i 1 µm sektioner fra overfladen af ​​biofilmen til dens base, idet den maksimale tykkelse af feltet og efterfølgende middeltykkelsen af ​​biofilmen af ​​den tilsvarende prøve blev målt. Den maksimale tykkelse af biofilmfelt blev defineret som afstanden mellem substratet (i vinkelret) og toppene af de højeste celleklynger. Den maksimale biofilmtykkelse af hvert felt blev opdelt i 3 zoner eller tilsvarende lag: ydre lag (lag 1), mellemlag (lag 2) og indre lag (lag 3).

Indsamlingen af ​​dataene blev udført med de samme indstillinger i alle tilfælde. Den rumlige scanningstilstand (XYZ) og 1024x1024 pixels scanningsformatopløsning blev brugt. Argon-ion- og DPSS-laseren blev brugt ved henholdsvis 13 % og 78 % af maksimal intensitet. Værdierne for pinhole, zoom og scanningshastighed var henholdsvis 121,58 mikron, 1 og 400Hz. De eneste værdier, der var forskellige afhængigt af prøven, var offset (interval mellem -1% til 1%) og PMT-forstærkning, som var forskellig for kanalrød og grøn, idet de generelt var højere for grøn end for rød (test og positiv kontrol), på grund af det faktum, at der var mere tilstedeværelse af grønt end rødt signal, idet det for den negative kontrol var det modsatte. Disse værdier blev altid justeret for at få en god kvalitetsoptagelse uden baggrundsstøj, hvilket undgår overdreven mætning af de lyseste pixels i billedet. Da teknikeren var blind over for eksperimentet, blev de rådet til at foretage justeringerne altid i overensstemmelse med, hvad der så af mikroskopets objektiv, for at opnå et billede, der var tættest muligt på virkeligheden.

Kvantificering af bakteriel vitalitet i serien af ​​XY-billeder blev bestemt ved anvendelse af cytofluorografisk analyse (Leica Confocal Software). I denne analyse blev billederne af hver fluorokrom defineret som "kanaler" (SYTO 9 optager den grønne kanal og propidiumiodid den røde kanal). Firkantede indfangningsmasker blev brugt til at måle det areal, der er optaget (µm2) af pixels i hver kanal, for at bestemme det samlede areal, der er optaget af biofilmen og den tilsvarende procentdel af vitalitet. Intensitetsintervallerne, der blev betragtet som positivt signal, var mellem 100 og 255. Bestemmelse af den gennemsnitlige procentdel af bakteriel vitalitet i hvert felt krævede sektioner med et minimumsareal af biofilm på 250 µm2, og den gennemsnitlige procentdel af bakteriel vitalitet af biofilmen blev beregnet for den tilsvarende prøve og for hvert biofilmlag.

Til kvantificering af procentdelen af ​​overfladesubstrat dækket af biofilmen (dækningsgrad) blev selve cytofluorogrammet brugt. Ud fra den maksimale projektion (superposition af alle opfangede planer) af hvert af de analyserede felter, blev procentdelen af ​​dækningsgrad opnået ved at beregne summen af ​​bakteriemassen (vital og ikke-vital) i forhold til den samlede overflade af feltet ( % positiv inden for det samlede areal).