Antiplaque-Wirkung von ätherischen Ölen und 0,2 % Chlorhexidin auf ein In-situ-Modell des oralen Biofilmwachstums.

Die Freiwilligen trugen zwei individualisierte Schienen, die 6 Glasscheiben (6 mm Durchmesser, 1 mm Dicke) halten konnten; Dies wurde bei 800er Körnung poliert. . Diese Schienen bestehen aus 2 Blättern, einem inneren 1 mm weichen Vinylblatt, an dem die Scheiben befestigt sind, und einem äußeren 1 mm starren Blatt aus Polyethylenterephtalat, das gefenstert ist.

• Mundwasserprotokoll Während der 96 Stunden (4 Tage) Dauer jedes Studiengangs trug jeder Freiwillige die Schienen mit den Glasscheiben und nahm sie nur während der Mahlzeiten aus der Mundhöhle (sie wurden in einem undurchsichtigen Behälter unter feuchten Bedingungen aufbewahrt) und zur Durchführung von Mundhygieneverfahren, bei denen bakterielle Plaque nur mechanisch mit Wasser entfernt wird, ohne Verwendung von Zahnpasta oder Mundspülung.

Unter Anwendung der zulässigen maschinellen Mundhygienemaßnahmen (ohne die Schienen) führten die Probanden die folgenden Protokolle gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den Schienen in der Mundhöhle während der 4 Tage morgens (8.30 Uhr) nach dem Frühstück und nachts ( 22.00) nach dem Abendessen:

A) 20 ml Spülungen für 30 Sekunden mit ätherischen Ölen/2 mal täglich. ----14 Tage---- B) 10 ml Spülungen für 30 Sekunden mit 0,2 % Chlorhexidin/2 mal täglich. ----14 Tage---- C) 20 ml Spülen für 30 Sekunden mit sterilem Wasser (Negativkontrolle). Unter Verwendung eines internetbasierten ausgewogenen Randomisierungssystems, das angibt, welche Mundspülung jeder Proband zuerst, zweitens und drittens verwenden würde, führten alle Freiwilligen die 3 Spülzyklen mit einer Ruhezeit von 14 Tagen zwischen jedem Test durch.

• Entnahme der Proben des Plaque-ähnlichen Biofilms Die Probenentnahme erfolgte individuell morgens um 8 Uhr, so dass die Proben jedes Probanden an unterschiedlichen Tagen analysiert wurden. Es wurde festgestellt, dass seit der letzten Mundspülung in der vorangegangenen Nacht mindestens 10 Stunden vergangen sein sollten.

Als die Glasscheiben von der Schiene entfernt wurden, wurden sie sofort in 100 &mgr;l Fluoreszenzlösung LIVE/DEAD® BacLight™ getaucht und 15 Minuten lang in einer dunklen Kammer bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die mikroskopische Beobachtung wurde von einem einzigen Prüfer, der das Studiendesign nicht kannte, unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Spektralmikroskops Leica TCS SP2 (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Deutschland) mit einem HCX APOL 63x/0,9 durchgeführt Wasserimmersionslinse.

• Verarbeitung der Proben des Plaque-ähnlichen Biofilms Vier ausgewählte Felder oder XYZ-Serien im zentralen Teil jeder Scheibe wurden bewertet. Diese Felder wurden nach der allgemeinen Untersuchung durch den Beobachter als repräsentativ für die gesamte Stichprobe angesehen. Die Fluoreszenzemission wurde in einer Reihe von XY-Bildern bestimmt, in denen jedes Bild jeder der Z-Positionen (Tiefe) entsprach. Die optischen Schnitte wurden in 1-µm-Schnitten von der Oberfläche des Biofilms bis zu seiner Basis gescannt, wobei die maximale Dicke des Felds und anschließend die mittlere Dicke des Biofilms der entsprechenden Probe gemessen wurden. Die maximale Dicke des Biofilmfeldes wurde als der Abstand zwischen dem Substrat (im Lot) und den Spitzen der höchsten Zellhaufen definiert. Die maximale Biofilmdicke jedes Feldes wurde in 3 Zonen oder äquivalente Schichten unterteilt: äußere Schicht (Schicht 1), mittlere Schicht (Schicht 2) und innere Schicht (Schicht 3).

Die Erfassung der Daten erfolgte in allen Fällen mit den gleichen Einstellungen. Es wurde der räumliche Scanmodus (XYZ) und die Auflösung des Scanformats 1024x1024 Pixel verwendet. Der Argon-Ionen- und der DPSS-Laser wurden bei 13 % bzw. 78 % der maximalen Intensität verwendet. Die Werte für Lochblende, Zoom und Scangeschwindigkeit betrugen 121,58 Mikron, 1 bzw. 400 Hz. Die einzigen Werte, die je nach Probe unterschiedlich waren, waren der Offset (Bereich zwischen -1 % bis 1 %) und die PMT-Verstärkung, die für die Kanäle Rot und Grün unterschiedlich war und im Allgemeinen für Grün höher war als für Rot (Test und Positiv Kontrolle), aufgrund der Tatsache, dass mehr grünes als rotes Signal vorhanden war, was bei der Negativkontrolle das Gegenteil war. Diese Werte wurden immer angepasst, um eine gute Aufnahmequalität ohne Hintergrundrauschen zu erhalten und eine übermäßige Sättigung der hellsten Pixel des Bildes zu vermeiden. Da der Techniker für das Experiment blind war, wurde ihm geraten, die Einstellungen immer im Einklang mit dem zu machen, was durch das Objektiv des Mikroskops gesehen wird, um ein Bild zu erhalten, das der Realität so nahe wie möglich kommt.

Die Quantifizierung der bakteriellen Vitalität in der Serie von XY-Bildern wurde mittels zytofluorographischer Analyse (Leica Confocal Software) bestimmt. Bei dieser Analyse wurden die Bilder jedes Fluorochroms als "Kanäle" definiert (SYTO 9 besetzt den grünen Kanal und Propidiumiodid den roten Kanal). Quadratische Erfassungsmasken wurden verwendet, um die von den Pixeln in jedem Kanal eingenommene Fläche (µm2) zu messen, wodurch die vom Biofilm eingenommene Gesamtfläche und der entsprechende Prozentsatz der Vitalität bestimmt wurden. Die Intensitätsbereiche, die als positives Signal gewertet wurden, lagen zwischen 100 und 255. Die Bestimmung des mittleren Prozentsatzes der bakteriellen Vitalität in jedem Feld erforderte Abschnitte mit einer Biofilm-Mindestfläche von 250 µm2, und der mittlere Prozentsatz der bakteriellen Vitalität des Biofilms wurde für die entsprechende Probe und für jede Biofilmschicht berechnet.

Zur Quantifizierung des Prozentsatzes des vom Biofilm bedeckten Oberflächensubstrats (Abdeckungsgrad) wurde das Zytofluorogramm selbst verwendet. Aus der maximalen Projektion (Überlagerung aller erfassten Ebenen) jedes der analysierten Felder wurde der prozentuale Bedeckungsgrad erhalten, indem die Summe der Bakterienmasse (vital und nicht vital) in Bezug auf die Gesamtfläche des Feldes berechnet wurde ( % positiv innerhalb der Gesamtfläche).