정유와 0.2% Chlorhexidine의 구강 생물막 성장 in situ 모델에 대한 항플라크 효과.

지원자들은 6개의 유리 디스크(직경 6mm, 두께 1mm)를 고정할 수 있는 두 개의 개별 부목을 착용했습니다. 이것은 800 그릿으로 연마되었습니다. . 이 부목은 디스크가 부착된 내부 1mm 연질 비닐 시트와 창공이 있는 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 만든 외부 1mm 단단한 시트의 2개 시트로 구성됩니다.

• 양치질 프로토콜 각 연구 과정의 96시간(4일) 기간 동안 각 지원자는 유리 디스크가 있는 부목을 착용하고 식사 중에만 구강에서 빼내고(다습한 조건에서 불투명한 용기에 보관) 치약이나 구강 세척제를 사용하지 않고 물로 박테리아 플라크를 기계적으로 제거하여 구강 위생 절차를 수행합니다.

허용된 기계적 구강 위생 조치(부목 없이)를 사용하여 지원자는 아침 식사 후 4일(8.30)과 밤에 부목을 구강에 두고 제조업체의 지침에 따라 다음 프로토콜을 수행했습니다. 22.00) 저녁 식사 후:

A) 매일 2회 에센셜 오일로 30초 동안 20ml를 헹굽니다. ----14일---- B) 매일 2회 0.2% 클로르헥시딘으로 30초 동안 10mL 헹구십시오. ----14일---- C) 20mL를 멸균수로 30초 동안 헹굽니다(음성 대조군). 각 피험자가 첫 번째, 두 번째 및 세 번째로 사용할 구강청결제를 나타내는 인터넷 기반의 균형 잡힌 무작위화 시스템을 사용하여 모든 지원자는 각 테스트 사이에 14일의 휴식 기간을 두고 3번의 헹굼 주기를 수행했습니다.

• Plaque like-biofilm 샘플 수집 샘플 수집은 오전 8시에 개별적으로 이루어졌으므로 각 지원자의 샘플은 서로 다른 날에 분석되었습니다. 전날 밤에 마지막으로 구강 세척을 한 후 최소 10시간이 경과해야 한다고 판단되었습니다.

유리 디스크가 부목에서 제거되면 즉시 100µL의 형광 용액 LIVE/DEAD® BacLight™에 담그고 실온의 어두운 챔버에 15분 동안 보관했습니다. HCX APOL 63x/0.9가 장착된 Leica TCS SP2 레이저 스캐닝 스펙트럼 공초점 현미경(Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Germany)을 사용하여 연구 설계를 알지 못하는 한 명의 조사자가 현미경 관찰을 수행했습니다. 침수 렌즈.

• Plaque like-Biofilm 샘플 처리 각 디스크의 중앙 부분에 있는 4개의 선택된 필드 또는 XYZ 시리즈를 평가했습니다. 이러한 필드는 관찰자의 일반 검사 후 전체 샘플을 대표하는 것으로 간주되었습니다. 형광 방출은 각 이미지가 각 Z 위치(깊이)에 해당하는 일련의 XY 이미지에서 결정되었습니다. 광학 섹션은 생물막 표면에서 베이스까지 1 μm 섹션으로 스캔되어 필드의 최대 두께와 해당 샘플의 생물막 평균 두께를 측정합니다. 생물막 필드의 최대 두께는 기판(수직)과 가장 높은 세포 클러스터의 피크 사이의 거리로 정의됩니다. 각 필드의 최대 생물막 두께는 3개의 영역 또는 동등한 레이어로 나누었습니다: 외부 레이어(레이어 1), 중간 레이어(레이어 2) 및 내부 레이어(레이어 3).

데이터 캡처는 모든 경우에 동일한 설정으로 수행되었습니다. 공간 스캔 모드(XYZ)와 1024x1024 픽셀 스캔 형식 해상도가 사용되었습니다. Argon-ion 레이저와 DPSS 레이저는 각각 최대 강도의 13%와 78%에서 사용되었습니다. 핀홀, 줌 및 스캔 속도의 값은 각각 121.58 미크론, 1 및 400Hz입니다. 샘플에 따라 다른 유일한 값은 오프셋(-1%에서 1% 사이의 범위)과 채널 빨간색과 녹색에 대해 다른 PMT 이득이었습니다. 일반적으로 빨간색(테스트 및 양성)보다 녹색이 더 높습니다. 대조군), 적색 신호보다 녹색 신호가 더 많이 존재한다는 사실로 인해 음성 대조군의 경우 반대입니다. 이 값은 이미지의 가장 밝은 픽셀의 과도한 채도를 피하면서 배경 노이즈 없이 좋은 품질의 캡처를 얻을 수 있도록 항상 조정되었습니다. 기술자는 실험에 대해 눈이 멀었기 때문에 가능한 한 현실에 가장 가까운 이미지를 얻기 위해 현미경의 대물렌즈로 보는 것과 항상 일치하도록 조정하라는 조언을 받았습니다.

일련의 XY 이미지에서 박테리아 활력의 정량화는 세포 형광 분석(Leica Confocal Software)을 사용하여 결정되었습니다. 이 분석에서 각 형광색소의 이미지는 "채널"로 정의되었습니다(SYTO 9는 녹색 채널을 차지하고 요오드화 프로피듐은 빨간색 채널을 차지함). 정사각형 캡처 마스크를 사용하여 각 채널의 픽셀이 차지하는 영역(µm2)을 측정하여 생물막이 차지하는 전체 영역과 해당하는 활력 비율을 결정했습니다. 양성 신호로 간주되는 강도 범위는 100에서 255 사이였습니다. 각 필드에서 최소 생물막 면적이 250 µm2인 섹션이 필요한 섹션에서 박테리아 활력의 평균 백분율을 결정하고 해당 샘플과 각 생물막 층에 대해 생물막의 박테리아 활력의 평균 백분율을 계산했습니다.

생물막(피복 등급)으로 덮힌 표면 기질의 백분율을 정량화하기 위해 세포형광도 자체를 사용했습니다. 분석된 각 필드의 최대 투영(포획된 모든 평면의 중첩)에서 필드의 전체 표면에 대한 세균 질량(생명 및 비활성)의 합을 계산하여 피복 등급의 백분율을 얻었습니다( 전체 면적 내에서 % 양성).