Antiplackeffekt av eteriska oljor och 0,2 % klorhexidin på en in situ-modell för oral biofilmtillväxt.

De frivilliga bar två individualiserade skenor som kunde hålla 6 glasskivor (6 mm i diameter, 1 mm tjocklek); denna polerades vid 800 grit. . Dessa skenor består av 2 skivor, en invändig 1 mm mjuk vinylskiva där skivorna är fästa och en extern 1 mm styv gjord av polyetylentereftalat som är fenestrerad.

• Munsköljningsprotokoll Under de 96 timmarna (4 dagar) varaktigheten av varje studiegång, bar varje frivillig skenorna med glasskivorna och drog ut dem från munhålan endast under måltiderna (de förvarades i en ogenomskinlig behållare under fuktiga förhållanden) och att utföra orala hygienprocedurer, genom att endast använda mekaniskt avlägsnande av bakteriell plack med vatten, utan användning av någon tandkräm eller munvatten.

Med hjälp av de tillåtna mekaniska munhygienåtgärderna (utan skenorna) utförde frivilliga följande protokoll baserat på tillverkarens instruktioner, med skenorna i munhålan, under de 4 dagarna på morgonen (8.30) efter frukost och på natten ( 22.00) efter middagen:

A) 20 ml sköljs i 30 sekunder med eteriska oljor/2 gånger dagligen. ----14 dagar---- B) 10 mL sköljs i 30 sekunder med 0,2 % klorhexidin/2 gånger dagligen. ----14 dagar---- C) 20 mL sköljs i 30 sekunder med sterilt vatten (negativ kontroll). Med hjälp av ett internetbaserat balanserat randomiseringssystem, som indikerar det munvatten som varje försöksperson skulle använda första, andra och tredje, utförde alla frivilliga de 3 sköljcyklerna, med en viloperiod på 14 dagar mellan varje test.

• Samling av proverna av plackliknande biofilm Provtagningen gjordes individuellt kl. 8 på morgonen, så att proverna från varje frivillig analyserades på olika dagar. Det fastställdes att minst 10 timmar borde ha förflutit sedan sista munsköljningen föregående natt.

När glasskivorna togs bort från skenan, nedsänktes de omedelbart i 100 µL fluorescenslösning LIVE/DEAD® BacLight™ och hölls i en mörk kammare vid rumstemperatur i 15 minuter. Mikroskopisk observation utfördes av en enda utredare som inte var medveten om studiens design, med hjälp av ett Leica TCS SP2 laserskanning spektralt konfokalmikroskop (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Tyskland) med en HCX APOL 63x/0.9 vattendoppande lins.

• Bearbetning av proverna av plackliknande biofilm Fyra utvalda fält eller XYZ-serier i den centrala delen av varje skiva utvärderades. Dessa fält ansågs representativa för hela urvalet efter observatörens allmänna undersökning. Fluorescensemission bestämdes i en serie XY-bilder där varje bild motsvarade var och en av Z-positionerna (djup). De optiska sektionerna skannades i 1 µm sektioner från ytan av biofilmen till dess bas, och mätte den maximala tjockleken av fältet och därefter medeltjockleken av biofilmen för motsvarande prov. Den maximala tjockleken av biofilmfältet definierades som avståndet mellan substratet (i vinkelrät) och topparna för de högsta cellklustren. Den maximala biofilmtjockleken för varje fält delades in i 3 zoner eller motsvarande skikt: yttre skikt (skikt 1), mellanskikt (skikt 2) och inre skikt (skikt 3).

Insamlingen av data gjordes med samma inställningar i alla fall. Spatial scan mode (XYZ) och 1024x1024 pixlar skanningsformatupplösning användes. Argonjon- och DPSS-lasern användes vid 13 % respektive 78 % av maximal intensitet. Värdena för pinhole, zoom och skanningshastighet var 121,58 mikron, 1 respektive 400 Hz. De enda värdena som var olika beroende på provet var offset (intervall mellan -1% till 1%) och PMT-förstärkning som var annorlunda för kanalröd och grön, i allmänna termer högre för grön än för röd (test och positiv kontroll), på grund av det faktum att det fanns mer närvaro av grön än röd signal, varvid för den negativa kontrollen var motsatsen. Dessa värden justerades alltid för att få en bra bildkvalitet utan bakgrundsbrus, vilket undviker överdriven mättnad av de ljusaste pixlarna i bilden. Eftersom teknikern var blind för experimentet, fick de rådet att göra justeringarna alltid i överensstämmelse med vad som sågs av mikroskopets objektiv, för att få en bild som var närmast verkligheten som möjligt.

Kvantifiering av bakteriell vitalitet i serien av XY-bilder bestämdes med användning av cytofluorografisk analys (Leica Confocal Software). I denna analys definierades bilderna av varje fluorokrom som "kanaler" (SYTO 9 upptar den gröna kanalen och propidiumjodid den röda kanalen). Fyrkantiga infångningsmasker användes för att mäta den yta som ockuperades (µm2) av pixlarna i varje kanal, för att bestämma den totala ytan som ockuperades av biofilmen och motsvarande procentandel av vitalitet. Intensitetsintervallen som ansågs vara positiva signaler var mellan 100 och 255. Bestämning av den genomsnittliga procentandelen av bakteriell vitalitet i varje fält krävde sektioner med en minsta biofilmarea på 250 µm2, och den genomsnittliga procentandelen av bakteriell vitalitet för biofilmen beräknades för motsvarande prov och för varje biofilmskikt.

För kvantifiering av procentandelen ytsubstrat som täcks av biofilmen (täckningsgrad) användes själva cytofluorogrammet. Från den maximala projektionen (överlagring av alla infångade plan) av vart och ett av de analyserade fälten, erhölls procentandelen täckningsgrad genom att beräkna summan av bakteriemassan (vital och icke-vital) med avseende på fältets totala yta ( % positiv inom total yta).