Antiplakkeffekt av essensielle oljer og 0,2 % klorheksidin på en in situ-modell for oral biofilmvekst.

De frivillige bar to individualiserte skinner som var i stand til å holde 6 glassplater (6 mm i diameter, 1 mm tykkelse); denne ble polert ved 800 grit. . Disse skinnene er formet av 2 ark, en innvendig 1 mm myk vinylplate hvor skivene er festet og en utvendig 1 mm stiv en laget av polyetylentereftalat som er fenestrert.

• Munnvannsprotokoll I løpet av 96 timer (4 dager) av hvert studiekurs, bar hver frivillig skinnene med glassskivene, og trakk dem ut av munnhulen kun under måltider (de ble lagret i en ugjennomsiktig beholder under fuktige forhold) og å utføre munnhygieneprosedyrer, kun ved hjelp av mekanisk fjerning av bakteriell plakk med vann, uten bruk av tannkrem eller munnvann.

Ved å bruke de tillatte mekaniske munnhygienetiltakene (uten skinnene), utførte de frivillige følgende protokoller basert på produsentens instruksjoner, med skinnene i munnhulen, i løpet av de 4 dagene om morgenen (8.30) etter frokost og om natten ( 22.00) etter middag:

A) 20 ml skyll i 30 sekunder med eteriske oljer/2 ganger daglig. ----14 dager---- B) 10 ml skyll i 30 sekunder med 0,2 % klorheksidin/2 ganger daglig. ----14 dager---- C) 20 mL skylles i 30 sekunder med sterilt vann (negativ kontroll). Ved å bruke et internettbasert balansert randomiseringssystem, som indikerer munnvannet som hver forsøksperson ville bruke første, andre og tredje, utførte alle frivillige de 3 skyllesyklusene, med en hvileperiode på 14 dager mellom hver test.

• Innsamling av prøvene av plakk-lignende biofilm. Prøvetaking ble gjort individuelt kl. 8 om morgenen, slik at prøvene til hver frivillig ble analysert på forskjellige dager. Det ble bestemt at det skulle ha gått minst 10 timer siden siste munnskyllevann forrige natt.

Da glassplatene ble fjernet fra skinnen, ble de umiddelbart nedsenket i 100 µL fluorescensløsning LIVE/DEAD® BacLight™ og holdt i et mørkt kammer ved romtemperatur i 15 minutter. Mikroskopisk observasjon ble utført av en enkelt etterforsker som ikke var klar over studiedesignet, ved bruk av et Leica TCS SP2 laserskanning spektralt konfokalmikroskop (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Tyskland) med en HCX APOL 63x/0.9 vannnedsenket linse.

• Behandling av prøvene av Plaque like-Biofilm Fire utvalgte felt eller XYZ-serier i den sentrale delen av hver disk ble evaluert. Disse feltene ble ansett som representative for hele utvalget etter observatørens generelle undersøkelse. Fluorescensemisjon ble bestemt i en serie XY-bilder der hvert bilde tilsvarte hver av Z-posisjonene (dybde). De optiske seksjonene ble skannet i 1 µm seksjoner fra overflaten av biofilmen til basen, og målte den maksimale tykkelsen på feltet og deretter gjennomsnittstykkelsen på biofilmen til den tilsvarende prøven. Den maksimale tykkelsen på biofilmfeltet ble definert som avstanden mellom substratet (i vinkelrett) og toppene til de høyeste celleklyngene. Maksimal biofilmtykkelse for hvert felt ble delt inn i 3 soner eller tilsvarende lag: ytre lag (lag 1), mellomlag (lag 2) og indre lag (lag 3).

Innsamlingen av data ble gjort med de samme innstillingene i alle tilfeller. Romlig skannemodus (XYZ) og skanneformatoppløsningen på 1024x1024 piksler ble brukt. Argonion- og DPSS-laseren ble brukt med henholdsvis 13 % og 78 % av maksimal intensitet. Verdiene for pinhole, zoom og skannehastighet var henholdsvis 121,58 mikron, 1 og 400Hz. De eneste verdiene som var forskjellige avhengig av prøven var offset (intervall mellom -1% til 1%) og PMT-forsterkning som var forskjellig for kanalrød og grønn, generelt sett høyere for grønn enn for rød (test og positiv kontroll), på grunn av det faktum at det var mer tilstedeværelse av grønt enn rødt signal, og for den negative kontrollen var det motsatte. Disse verdiene ble alltid justert for å få et bilde av god kvalitet uten bakgrunnsstøy, for å unngå overdreven metning av de lyseste pikslene i bildet. Siden teknikeren var blind for eksperimentet, ble de rådet til å gjøre justeringene alltid i samsvar med det som ble sett av objektivet til mikroskopet, og få et bilde som var nærmest mulig virkeligheten.

Kvantifisering av bakteriell vitalitet i serien av XY-bilder ble bestemt ved bruk av cytofluorografisk analyse (Leica Confocal Software). I denne analysen ble bildene av hver fluorokrom definert som "kanaler" (SYTO 9 okkuperer den grønne kanalen og propidiumjodid den røde kanalen). Firkantede fangemasker ble brukt til å måle arealet som ble okkupert (µm2) av pikslene i hver kanal, og bestemte det totale arealet som ble okkupert av biofilmen og den tilsvarende prosentandelen av vitalitet. Intensitetsområdene som ble ansett som positivt signal var mellom 100 og 255. Bestemmelse av gjennomsnittlig prosentandel av bakteriell vitalitet i hvert felt krevde seksjoner med et minimumsareal av biofilm på 250 µm2, og gjennomsnittsprosenten av bakteriell vitalitet av biofilmen ble beregnet for den tilsvarende prøven og for hvert biofilmlag.

For kvantifisering av prosentandelen av overflatesubstrat som dekkes av biofilmen (dekkkvalitet), ble selve cytofluorogrammet brukt. Fra maksimal projeksjon (superposisjon av alle fangede fly) av hvert av de analyserte feltene, ble prosentandelen av dekningsgrad oppnådd ved å beregne summen av bakteriemassen (vital og ikke-vital) i forhold til den totale overflaten av feltet ( % positiv innenfor totalt areal).