M. Ulcerans病、ブルリ潰瘍の病因と管理 (Buruli_Path)

手続き

感染した参加者

標準的な世界保健機関のフォーム (BU01) を使用して人口統計データを収集し、初期の病変 (結節、プラーク、および潰瘍) が最初に観察された時期を確認するための慎重な履歴とともに、病変の種類と寸法をデジタル写真とトレースと共に記録します。アセテートシートに。 浮腫性病変については、デジタル写真のみが取得されます。 患者は、標準的な抗生物質治療（リファンピシン10mg / kgおよびストレプトマイシン15mg / kg）中に2週間間隔でレビューされ、すべての通常の患者に対して行われるように臨床データがさらに記録されます。 これらの測定により、病変のサイズとタイプに関連する治癒速度と治癒時間の計算が可能になります。 患者は、患者の約8％で治療開始後に発生する逆説的反応について監視されます。 これらの手順は、ブルーリ潰瘍患者の定期的なケアの一環として定期的に提供されます。

サンプル

研究のために患者から必要な追加のサンプルは、追加の血液 (7ml) と、患者がこれらの時点で病変を有する場合にのみ (ベースライン、4、8、12、および 16 週目) 時々採取される 3 つのスワブです。 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって検出された微生物がまだ生存しているかどうかを判断するには、スワブ/細針吸引液が必要です。1 つは M. ulcerans 培養用、もう 1 つはマイコラクトン濃度の測定用、もう 1 つは組み合わせた 16S リボソーム リボ核酸 (rRNA) 逆転写酵素用です。 / 挿入配列 IS2404 リアルタイム qPCR アッセイ (1)。

治療中に逆説的な病変を発症した患者の場合、追加の血液サンプルと 3 つのスワブ/細針吸引物が生存マーカーの反応時に得られます (M. ulcerans 培養、16S rRNA 逆転写酵素/IS2404 リアルタイム定量的ポリメラーゼ チェーンの組み合わせ)反応 (qPCR) アッセイおよびマイコラクトン検出)。

浮腫性病変の場合、潰瘍化した病変からのマイコラクトンの検出と定量化のために、1 つのスワブ/細針吸引物が得られます。 患者が 15 歳以上の場合に限り、同じ目的で潰瘍のない病変に対して局所麻酔下で 3 mm のパンチ生検を行います。

M. ulcerans 感染のルーチン診断の確立された方法は、抗酸菌 (AFB) の検出、培養、および IS2404 の PCR のために非潰瘍性病変から細針吸引物を採取することです。 この標本は、マイコラクトンの定量化に十分な大きさではありません。これは、潰瘍を伴わないことが多い浮腫性疾患の病因に関する調査の重要な部分です。 スワブは潰瘍の診断に使用されます。

コントロール 風土病村の患者と非風土病村の健康な対照者の家庭内接触者については、Luminex アッセイによるタンパク質バイオマーカー、フローサイトメトリーによる T 細胞サブセット、および酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA) を使用した免疫応答を調査するために、7 ml の血液サンプルが取得されます。比較研究のための全血アッセイ。 組織生検は行われません。

逆説的反応の定義 逆説的反応は、最初の改善とサイズの減少の後、100%を超える病変サイズの増加を伴う炎症性変化の増加として定義されます。および/または抗マイコバクテリア治療後または治療中の新しい病変の出現。

調査 ラピッドレスポンダーの検出: バイオマーカー、組織マイコラクトン濃度、および免疫応答をベースラインで測定します。 治癒率は、病変の初期サイズと以前のように治癒を完了するまでの時間を記録することによって推定されます (2)。

Mu の検出: スワブ ホモジネートを培養のために Lowenstein Jensen 斜面に接種し、AFB のために Ziehl-Neelsen 染色塗抹標本で顕微鏡検査を行います。 IS2404 の PCR は、前述のように実行されます (3)。

バイオマーカー:

血清サンプルは、Luminex 多検体プロファイリングを使用して多検体プロファイリングにかけられ、浮腫性疾患、逆説的反応、迅速な対応者のマーカーを特定します。

また、質量分析ベースのプロテオミクスを使用して、3 段階のアプローチで追加の血清/組織バイオマーカーを生成します。 最初に、サンプルの分画と質量分析 (マトリックス支援レーザー脱離/イオン化/飛行時間/質量分析) を使用して、抗生物質で治療される被験者からのサンプルのプロテオミクス組成の変動の程度を決定します。 この最初のスクリーニングにより、部分的な反応を示す被験者の特定と除外、および最も異なる反応を示す被験者のその後の分析が可能になります。 ステージ 2 は、特定された応答グループのそれぞれからプールされたサンプル (各応答コホートからランダムに生成された 3 つのプール) のディープ液体クロマトグラフィー質量分析 (LC/MS/MS) ベースの定量分析で構成されます。 有意な変化を示す分子は、薬物反応の候補バイオマーカーと見なされます。 ステージ 3 では、各新規バイオマーカーの有効性を個別に、または既存のバイオマーカーと組み合わせて薬物反応を予測する能力をテストするために、イムノアッセイ (ELISA) が開発されます。

免疫応答: 全血サンプルを Mu 抗原と一緒に摂氏 37 度で一晩インキュベートし、上澄み液を保存して、以前の研究と同様に ELISA を使用してサイトカインアッセイを行います (4)。

抗原で刺激されたT細胞集団は、フローサイトメトリーによっても研究され、対照と比較した患者のインターフェロン（IFN）ガンマ、腫瘍壊死因子（TNF）、およびインターロイキン-2（IL2）分泌T細胞の割合を評価します。

マイコラクトンの検出: 脂質は、均質化された皮膚生検およびスワブ//細針吸引物から抽出され、ミコラクトンの生物学的活性は、標的細胞としてヒト胚性肺線維芽細胞を使用して、前述の細胞毒性アッセイによって測定されます。 組織サンプル中のマイコラクトンの存在は、前述のように質量分析法によって確認および定量化されます (5)。 浮腫性病変から分離された Mu 株によるミコラクトン産生は、in vitro で定量化され、浮腫性病変におけるミコラクトンの組織濃度が測定されます。

サンプルサイズと正当化 この研究には 450 人の参加者がいます。 私たちの以前の研究では、ベースラインでの高速応答者と低速応答者の間の TNF α の平均差は 15pg/ml であり、標準偏差は 33pg/ml であることが示されました。 d=15/33 として計算された標準化された平均差は 0.45 でした。 5% の両側有意性と 80% の検出力でこの差を検出するために必要なサンプル サイズは、各グループの 100 人の参加者 (200 人の患者) になります。 サンプルサイズが 250 人の患者になると、20% の減少率が予想されます。 200人の健康なボランティアのコントロールグループがあります

統計分析 この研究の目的のために、「迅速な対応者または迅速な対応者」は、治癒までの時間が 12 週間未満、または治癒率が 4mm/週を超える患者と定義され、「遅い対応者または遅い治癒者」は、治癒までの時間が 12 週間以上、または治癒速度が 3 mm/週未満の患者と定義

多検体プロファイリングによって生成されたデータは、SIMCA 13 ソフトウェア (Umetrics、スウェーデン) を使用して、主成分分析 (PCA) および部分最小二乗法 (PLS) 関連の方法を含む多変量解析によって分析されます。 候補バイオマーカーをさらに特徴付けるために、単変量解析が行われます。 ここでは、ノンパラメトリック Wilcoxon 順位和 (Mann-Whitney) 検定を使用して、コントロールと疾患患者の違いを分析します。 ウィルコクソンの符号付き順位検定を使用して、0週目と12週目のBUD患者の対のサンプルを比較します。 R ソフトウェア (バージョン 2.13.2、R Development Core Team、R Foundation for Statistical Computing、ウィーン、オーストリア) およびパッケージ QVALUE を使用して、単変量解析と複数のテスト調整を実行します。 GraphPad Prism ソフトウェアは、グラフ表示に使用されます。