Pathogenese en beheer van de ziekte van M. Ulcerans, Buruli Ulcer (Buruli_Path)

Procedures

Geïnfecteerde deelnemers

Na het verzamelen van demografische gegevens met behulp van standaardformulieren van de Wereldgezondheidsorganisatie (BU01) samen met een zorgvuldige geschiedenis om vast te stellen wanneer vroege laesies (knobbeltjes, plaques en zweren) voor het eerst werden waargenomen, zullen het type en de afmetingen van de laesies worden gedocumenteerd samen met digitale foto's en traceringen op acetaatvellen. Voor oedeemletsels worden alleen digitale foto's verkregen. Patiënten zullen tijdens de standaardbehandeling met antibiotica (rifampicine 10 mg/kg en streptomycine 15 mg/kg) met tussenpozen van 2 weken worden beoordeeld met verdere registratie van klinische gegevens, zoals wordt gedaan voor alle routinepatiënten. Met deze metingen kan de genezingssnelheid en de genezingstijd worden berekend in relatie tot de grootte en het type van de laesie. Patiënten zullen worden gecontroleerd op paradoxale reacties die optreden na de start van de behandeling bij ongeveer 8% van de patiënten. Deze procedures worden routinematig uitgevoerd als onderdeel van de routinematige zorg voor Buruli-ulcuspatiënten.

Monsters

De aanvullende monsters die voor het onderzoek van de patiënten nodig zijn, zijn een extra hoeveelheid bloed (7 ml) en 3 uitstrijkjes die af en toe worden afgenomen (bij aanvang, week 4, 8, 12 en 16) alleen wanneer de patiënt op deze tijdstippen een laesie heeft. Er zijn wattenstaafjes/aspiraten met een fijne naald nodig om te bepalen of organismen die door de polymerasekettingreactie (PCR) zijn gedetecteerd, nog steeds levensvatbaar zijn, één voor M. ulcerans-kweek, één voor meting van de mycolactonconcentratie en één voor gecombineerd 16S ribosomaal ribonucleïnezuur (rRNA) reverse transcriptase / insertievolgorde IS2404 Real-Time qPCR-assay (1).

Voor patiënten die tijdens de therapie paradoxale laesies ontwikkelen, zullen op het moment van de reactie een extra bloedmonster en 3 uitstrijkjes/fijnnaaldaspiraten worden afgenomen voor levensvatbaarheidsmarkers (M. ulcerans-kweek, gecombineerd 16S rRNA reverse transcriptase / IS2404 Real-Time kwantitatieve polymeraseketen reactie (qPCR) assay en mycolactondetectie).

Voor oedemateuze laesies zal één uitstrijkje/fijne naaldaspiraat worden verkregen voor mycolactondetectie en kwantificering van laesies die verzweerd zijn. Een ponsbiopsie van 3 mm zal onder plaatselijke verdoving worden uitgevoerd op niet-verzweerde laesies voor hetzelfde doel, maar alleen als de patiënt 15 jaar of ouder is.

Gevestigde praktijk voor routinematige diagnose van M. ulcerans-infectie is het afnemen van fijne naaldaspiraten van niet-verzweerde laesies voor detectie van zuurvaste bacillus (AFB), kweek en PCR voor IS2404. Dit exemplaar is niet groot genoeg voor mycolactonkwantificering, een belangrijk onderdeel van het onderzoek naar de pathogenese van oedeemziekte die zich vaak zonder ulceratie voordoet. Wattenstaafjes worden gebruikt bij de diagnose van zweren.

Controles Voor de huishoudelijke contacten van patiënten in endemische dorpen en gezonde controles in niet-endemische dorpen zal een bloedmonster van 7 ml worden afgenomen om eiwitbiomarkers te onderzoeken door Luminex-assay, T-celsubsets door flowcytometrie en immuunresponsen met behulp van Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) in een volbloedtest voor vergelijkende studies. Er worden geen weefselbiopten genomen.

Definitie van paradoxale reactie Paradoxale reactie wordt gedefinieerd als een toename van ontstekingsveranderingen met een toename van de laesiegrootte van meer dan 100%, na initiële verbetering en afname in grootte; en/of het verschijnen van nieuwe laesies na of tijdens antimycobacteriële behandeling.

Onderzoeken Detectie van snelle responders: Biomarkers, weefselmycolactonconcentratie en immuunrespons zullen worden gemeten bij baseline. De snelheid van genezing zal worden geschat door de aanvankelijke grootte van de laesie en de tijd tot volledige genezing te documenteren zoals eerder (2).

Detectie van Mu: homogenaten van uitstrijkjes zullen worden geïnoculeerd op Lowenstein Jensen-hellingen voor kweek en microscopie zal worden uitgevoerd op Ziehl-Neelsen-gekleurde uitstrijkjes voor AFB. PCR voor IS2404 zal worden uitgevoerd zoals eerder beschreven (3).

Biomarkers:

Serummonsters zullen worden onderworpen aan multi-analyt-profilering met behulp van Luminex multi-analyt-profilering om markers van oedeemziekte, paradoxale reacties en snelle responders te identificeren.

We zullen ook op massaspectrometrie gebaseerde proteomics gebruiken om aanvullende biomarkers voor serum/weefsel te genereren via een aanpak in drie fasen. Eerst zullen we staalfractionering en massaspectrometrie (matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie/vluchttijd/massaspectrometrie) gebruiken om de mate van variabiliteit van de proteomische samenstelling te bepalen in stalen van proefpersonen die behandeld moeten worden met antibiotica. Deze eerste screening maakt het mogelijk om proefpersonen met een gedeeltelijke respons te identificeren en te verwijderen, en vervolgens om de meest uiteenlopende reacties te analyseren. Fase 2 omvat een op diepe vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC/MS/MS) gebaseerde kwantitatieve analyse van gepoolde monsters (3 pools willekeurig gegenereerd uit elk responscohort) van elk van de geïdentificeerde responsgroepen. Moleculen die significante veranderingen vertonen, zullen worden beschouwd als kandidaat-biomarkers voor de respons op geneesmiddelen. In fase 3 zullen immunoassays (ELISA) worden ontwikkeld om de validiteit van elke nieuwe biomarker te testen op zijn vermogen afzonderlijk of in combinatie met bestaande biomarkers om de respons op geneesmiddelen te voorspellen.

Immuunrespons: Volbloedmonsters zullen 's nachts bij 37 graden Celsius worden geïncubeerd met Mu-antigenen en het supernatant zal worden opgeslagen voor cytokine-assays met behulp van ELISA, zoals in onze eerdere onderzoeken (4).

Antigeen-gestimuleerde T-celpopulaties zullen ook worden bestudeerd door middel van flowcytometrie om het aandeel van Interferon(IFN)-gamma, Tumornecrosefactor (TNF) en interleukine-2 (IL2)-uitscheidende T-cellen bij patiënten te beoordelen in vergelijking met controles.

Detectie van mycolacton: Lipiden zullen worden geëxtraheerd uit gehomogeniseerde huidbiopten en uitstrijkjes//aspiraten met fijne naalden en de biologische activiteit van mycolacton zal worden gemeten door middel van een cytotoxiciteitsassay zoals eerder beschreven met menselijke embryonale longfibroblasten als doelcellen. De aanwezigheid van mycolacton in weefselmonsters zal worden bevestigd en gekwantificeerd door middel van massaspectrometrie, zoals eerder beschreven (5). De productie van mycolacton door de stam van Mu geïsoleerd uit oedeemletsels zal in vitro worden gekwantificeerd en de weefselconcentratie van mycolacton in oedeemletsels zal worden gemeten.

Steekproefomvang en verantwoording Er zullen 450 deelnemers aan dit onderzoek deelnemen. Onze eerdere onderzoeken toonden een gemiddeld verschil in TNF-alfa bij baseline tussen snelle en langzame responders van 15 pg/ml en een standaarddeviatie van 33 pg/ml. Het gestandaardiseerde gemiddelde verschil berekend als d=15/33 was 0,45. De steekproefomvang die nodig is om dit verschil te detecteren met een tweezijdige significantie van 5% en met 80% power zou 100 deelnemers in elke groep zijn (dat zijn 200 patiënten). We verwachten een uitvalpercentage van 20%, waarmee de steekproefomvang op 250 patiënten komt. Er zal een controlegroep zijn van 200 gezonde vrijwilligers

Statistische analyse Voor het doel van deze studie wordt een "snel reagerende of snelle reagerende" gedefinieerd als een patiënt met een genezingstijd van minder dan 12 weken of een genezingssnelheid van meer dan 4 mm/week en "slow reagerende of trage genezer" is gedefinieerd als een patiënt met een genezingstijd van 12 of meer weken of een genezingssnelheid van minder dan 3 mm/week

Gegevens gegenereerd door multianalyt-profilering zullen worden geanalyseerd door middel van multivariate analyse, inclusief principale-componentenanalyse (PCA) en gedeeltelijke kleinste kwadraten (PLS)-gerelateerde methoden, met behulp van de SIMCA 13-software (Umetrics, Zweden). Univariate analyses zullen worden uitgevoerd om kandidaat-biomarkers verder te karakteriseren. Hier zullen verschillen tussen controles en zieke patiënten worden geanalyseerd met behulp van de niet-parametrische Wilcoxon rank sum (Mann-Whitney) test. Gepaarde monsters voor BUD-patiënten in week 0 en week 12 zullen worden vergeleken met behulp van de door Wilcoxon ondertekende rangtest. Univariate analyse en meervoudige testaanpassingen zullen worden uitgevoerd met behulp van R-software (versie 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Wenen, Oostenrijk) en pakket QVALUE. GraphPad Prism-software zal worden gebruikt voor grafische weergave.