Patogénesis y manejo de la enfermedad de M. ulcerans, úlcera de Buruli (Buruli_Path)

Procedimientos

Participantes infectados

Después de la recopilación de datos demográficos utilizando formularios estándar de la Organización Mundial de la Salud (BU01) junto con un historial cuidadoso para establecer cuándo se observaron por primera vez las lesiones tempranas (nódulos, placas y úlceras), el tipo y las dimensiones de las lesiones se documentarán junto con fotografías y trazados digitales. en hojas de acetato. Para lesiones edematosas solo se obtendrán fotografías digitales. Los pacientes serán revisados ​​a intervalos de 2 semanas durante el tratamiento antibiótico estándar (rifampicina 10 mg/kg y estreptomicina 15 mg/kg) con más registros de datos clínicos como se hace con todos los pacientes de rutina. Estas medidas permitirán el cálculo de la tasa de curación y el tiempo de curación en relación con el tamaño y el tipo de lesión. Los pacientes serán monitoreados por reacciones paradójicas que ocurren después del inicio del tratamiento en aproximadamente el 8% de los pacientes. Estos procedimientos se proporcionan de forma rutinaria como parte de la atención de rutina de los pacientes con úlcera de Buruli.

Muestras

Las muestras adicionales requeridas de los pacientes para el estudio son un volumen adicional de sangre (7 ml) y 3 hisopos tomados en ocasiones (al inicio, semana 4, 8, 12 y 16) solo cuando el paciente tiene una lesión en estos momentos. Se requieren hisopos/aspirados con aguja fina para determinar si los organismos detectados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) siguen siendo viables, uno para el cultivo de M. ulcerans, uno para medir la concentración de micolactona y otro para la transcriptasa inversa del ácido ribonucleico ribosomal (ARNr) 16S combinado / secuencia de inserción Ensayo qPCR en tiempo real IS2404 (1).

Para los pacientes que desarrollen lesiones paradójicas durante la terapia, se obtendrá una muestra de sangre adicional y 3 hisopos/aspirados con aguja fina en el momento de la reacción para marcadores de viabilidad (cultivo de M. ulcerans, transcriptasa inversa de ARNr 16S combinada/cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real IS2404). ensayo de reacción (qPCR) y detección de micolactona).

Para las lesiones edematosas, se obtendrán aspirados con un hisopo/aguja fina para la detección y cuantificación de micolactona a partir de lesiones ulceradas. Se realizará una biopsia en sacabocados de 3 mm bajo anestesia local en lesiones no ulceradas con el mismo propósito solo cuando el paciente tenga 15 años o más.

La práctica establecida para el diagnóstico de rutina de la infección por M. ulcerans es tomar aspiraciones con aguja fina de lesiones no ulceradas para la detección, cultivo y PCR de bacilos acidorresistentes (BAAR) para IS2404. Esta muestra no es lo suficientemente grande para la cuantificación de micolactona, una parte importante de la investigación de la patogenia de la enfermedad edematosa que a menudo se presenta sin ulceración. Los hisopos se utilizan en el diagnóstico de úlceras.

Controles Para los contactos domésticos de pacientes en aldeas endémicas y controles sanos en aldeas no endémicas, se obtendrá una muestra de sangre de 7 ml para investigar biomarcadores de proteínas mediante el ensayo Luminex, subconjuntos de células T mediante citometría de flujo y respuestas inmunitarias mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) en un análisis de sangre total para estudios comparativos. No se tomarán biopsias de tejido.

Definición de reacción paradójica Se definirá reacción paradójica como un aumento de los cambios inflamatorios con aumento del tamaño de la lesión superior al 100%, tras la mejoría inicial y disminución del tamaño; y/o la aparición de nuevas lesiones después o durante el tratamiento antimicobacteriano.

Investigaciones Detección de respondedores rápidos: Los biomarcadores, la concentración tisular de micolactona y la respuesta inmunitaria se medirán al inicio del estudio. La tasa de curación se estimará documentando el tamaño inicial de la lesión y el tiempo para completar la curación como se hizo anteriormente (2).

Detección de Mu: Los homogeneizados de hisopos se inocularán en pendientes Lowenstein Jensen para cultivo y se llevará a cabo microscopía en frotis teñidos con Ziehl-Neelsen para AFB. La PCR para IS2404 se llevará a cabo como se describe anteriormente (3).

Biomarcadores:

Las muestras de suero se someterán a un perfil multianalito utilizando el perfil multianalito Luminex para identificar marcadores de enfermedad edematosa, reacciones paradójicas y respuestas rápidas.

También utilizaremos proteómica basada en espectrometría de masas para generar biomarcadores de suero/tejidos adicionales mediante un enfoque de tres etapas. En primer lugar, utilizaremos el fraccionamiento de muestras y la espectrometría de masas (desorción láser asistida por matriz/ionización/tiempo de vuelo/espectrometría de masas) para determinar el grado de variabilidad de la composición proteómica en muestras de sujetos que se van a tratar con antibióticos. Este primer cribado permitirá la identificación y eliminación de los sujetos que presenten una respuesta parcial y el posterior análisis de aquellos que muestren respuestas más dispares. La etapa 2 comprende un análisis cuantitativo basado en cromatografía líquida profunda (LC/MS/MS) de muestras agrupadas (3 agrupaciones generadas aleatoriamente de cada cohorte de respuesta) de cada uno de los grupos de respuesta identificados. Las moléculas que muestren cambios significativos serán consideradas biomarcadores candidatos de respuesta a fármacos. En la Etapa 3, se desarrollarán inmunoensayos (ELISA) para probar la validez de cada nuevo biomarcador en su capacidad por separado o en combinación con biomarcadores existentes para predecir la respuesta a fármacos.

Respuesta inmunitaria: las muestras de sangre completa se incubarán con antígenos Mu durante la noche a 37 grados centígrados y el sobrenadante se almacenará para ensayos de citocinas mediante ELISA como en nuestros estudios anteriores (4).

Las poblaciones de células T estimuladas por antígeno también se estudiarán mediante citometría de flujo para evaluar la proporción de células T secretoras de interferón (IFN) gamma, factor de necrosis tumoral (TNF) e interleucina-2 (IL2) en pacientes en comparación con los controles.

Detección de micolactona: los lípidos se extraerán de biopsias de piel homogeneizadas y torundas//aspirados con aguja fina y la actividad biológica de la micolactona se medirá mediante un ensayo de citotoxicidad como se describió anteriormente utilizando fibroblastos de pulmón embrionario humano como células diana. La presencia de micolactona en muestras de tejido se confirmará y cuantificará mediante espectrometría de masas como se describió anteriormente (5). Se cuantificará in vitro la producción de micolactona por la cepa de Mu aislada de lesiones edematosas y se medirá la concentración tisular de micolactona en lesiones edematosas.

Tamaño de la muestra y justificación Habrá 450 participantes en este estudio. Nuestros estudios previos mostraron una diferencia media en TNF alfa al inicio entre los respondedores rápidos y lentos de 15 pg/ml y una desviación estándar de 33 pg/ml. La diferencia media estandarizada calculada como d=15/33 fue 0,45. El tamaño de la muestra necesario para detectar esta diferencia con una significación bilateral del 5 % y con un poder del 80 % sería de 100 participantes en cada grupo (es decir, 200 pacientes). Esperamos una tasa de deserción del 20 %, lo que eleva el tamaño de la muestra a 250 pacientes. Habrá grupo control de 200 voluntarios sanos

Análisis estadístico Para los fines de este estudio, una "respuesta rápida o una respuesta rápida" se define como un paciente con un tiempo de curación de menos de 12 semanas o una tasa de curación de más de 4 mm/semana y "respuesta lenta o curación lenta" es definido como un paciente con tiempo de curación de 12 o más semanas o tasa de curación de menos de 3 mm/semana

Los datos generados por el perfilado de múltiples analitos se analizarán mediante análisis multivariado, incluido el análisis de componentes principales (PCA) y métodos relacionados con mínimos cuadrados parciales (PLS), utilizando el software SIMCA 13 (Umetrics, Suecia). Se realizarán análisis univariados para caracterizar aún más los biomarcadores candidatos. Aquí, las diferencias entre los controles y los pacientes con enfermedad se analizarán utilizando la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon (Mann-Whitney). Las muestras pareadas de pacientes con BUD en la semana 0 y la semana 12 se compararán mediante la prueba de rangos con signos de Wilcoxon. El análisis univariado y los ajustes de pruebas múltiples se realizarán utilizando el software R (versión 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria) y el paquete QVALUE. El software GraphPad Prism se utilizará para la representación gráfica.