M. Ulceransin taudin, Buruli-haavan patogeneesi ja hoito (Buruli_Path)

Menettelyt

Tartunnan saaneet osallistujat

Kun demografiset tiedot on kerätty käyttäen Maailman terveysjärjestön vakiolomakkeita (BU01) sekä huolellinen historia sen selvittämiseksi, milloin varhaiset leesiot (kyhmyt, plakit ja haavaumat) havaittiin ensimmäisen kerran, leesioiden tyyppi ja mitat dokumentoidaan yhdessä digitaalisten valokuvien ja jälkien kanssa. asetaattilevyille. Turvotuista leesioista saadaan vain digitaalisia valokuvia. Potilaat tarkistetaan kahden viikon välein tavanomaisen antibioottihoidon aikana (rifampisiini 10 mg/kg ja streptomysiini 15 mg/kg) ja kliiniset tiedot tallennetaan edelleen, kuten kaikille rutiinipotilaille tehdään. Nämä mittaukset mahdollistavat paranemisnopeuden ja paranemisajan laskemisen leesion koon ja tyypin mukaan. Potilaita seurataan paradoksaalisten reaktioiden varalta, joita ilmenee hoidon aloittamisen jälkeen noin 8 %:lla potilaista. Näitä toimenpiteitä tarjotaan rutiininomaisesti osana Buruli-haavapotilaiden rutiinihoitoa.

Näytteet

Potilailta tutkimukseen vaadittavat lisänäytteet ovat ylimääräinen veritilavuus (7 ml) ja 3 vanupuikkoa, jotka on otettu toisinaan (perustilanteessa, viikolla 4, 8, 12 ja 16) vain silloin, kun potilaalla on vaurio näinä aikoina. Vanupuikkoja/hienoja neulaaspiraatteja tarvitaan sen määrittämiseksi, ovatko polymeraasiketjureaktiolla (PCR) havaitut organismit edelleen elinkelpoisia, yksi M. ulcerans -viljelmälle, yksi mykolaktonipitoisuuden mittaamista varten ja yksi yhdistetylle 16S ribosomaalisen ribonukleiinihapon (rRNA) käänteiskopioijaentsyymille. / insertiosekvenssi IS2404 Real-Time qPCR-määritys (1).

Potilaille, joille kehittyy paradoksaalisia leesioita hoidon aikana, reaktion yhteydessä otetaan ylimääräinen verinäyte ja 3 vanupuikkoa/hieno neulaaspiraattia elinkykymarkkereita varten (M. ulcerans -viljelmä, yhdistetty 16S rRNA-käänteiskopioija / IS2404 Real-Time kvantitatiivinen polymeraasiketju reaktio (qPCR) -määritys ja mykolaktonin havaitseminen).

Turvotuista leesioista otetaan yksi vanupuikko/hieno neulaaspiraatti mykolaktonin havaitsemiseksi ja haavoimien leesioiden kvantifiointiin. 3 mm:n lyöntibiopsia tehdään paikallispuudutuksessa haavattomille vaurioille samaan tarkoitukseen vain, kun potilas on 15-vuotias tai vanhempi.

Vakiintunut käytäntö M. ulcerans -infektion rutiininomaisessa diagnosoinnissa on ottaa ohuita neula-aspiraatteja haavautumattomista leesioista haponkestävän basillin (AFB) havaitsemiseksi, viljelemiseksi ja PCR:ksi IS2404:ää varten. Tämä näyte ei ole riittävän suuri mykolaktonin kvantifiointiin, mikä on tärkeä osa turvotustaudin patogeneesin tutkimusta, joka on usein ilman haavaumia. Vanupuikkoja käytetään haavaumien diagnosoinnissa.

Kontrollit Kotoperäisten kylien potilaiden ja terveiden kontrollien ei-endeemisten kylien potilaiden kotikontakteista otetaan 7 ml:n verinäyte proteiinien biomarkkerien tutkimiseksi Luminex-määrityksellä, T-solualaryhmien tutkimiseksi virtaussytometrialla ja immuunivasteita käyttämällä entsyymikytkentäistä immunosorbenttimääritystä (ELISA) vertailevien tutkimusten kokoverimäärityksessä. Kudosbiopsiaa ei oteta.

Paradoksaalisen reaktion määritelmä Paradoksaalinen reaktio määritellään tulehduksellisten muutosten lisääntymisenä, kun leesion koko on suurempi kuin 100 % alkuparannuksen ja koon pienenemisen jälkeen; ja/tai uusien leesioiden ilmaantuminen antimykobakteerihoidon jälkeen tai sen aikana.

Tutkimukset Nopeasti reagoivien havaitseminen: Biomarkkerit, kudoksen mykolaktonipitoisuus ja immuunivaste mitataan lähtötasolla. Paranemisnopeus arvioidaan dokumentoimalla vaurion alkuperäinen koko ja parantumiseen kuluva aika kuten aiemmin (2).

Mu:n havaitseminen: Vanupuikkohomogenaatit siirrostetaan Lowenstein Jensenin rinteisiin viljelyä varten ja mikroskooppi suoritetaan Ziehl-Neelsenin värjätyillä AFB:n sivelysoluilla. PCR IS2404:lle suoritetaan kuten aiemmin on kuvattu (3).

Biomarkkerit:

Seeruminäytteille tehdään monianalyytin profilointi käyttämällä Luminex-monianalyyttiprofilointia turvotussairauden, paradoksaalisten reaktioiden ja nopean vasteen merkkiaineiden tunnistamiseksi.

Käytämme myös massaspektrometriaan perustuvaa proteomiikkaa luodaksemme lisää seerumin/kudoksen biomarkkereita käyttämällä kolmivaiheista lähestymistapaa. Ensin käytämme näytteen fraktiointia ja massaspektrometriaa (matriisiavusteinen laserdesorptio/ionisaatio/lentoaika/massaspektrometria) määrittääksemme proteomisen koostumuksen vaihteluasteen näytteissä, joita hoidetaan antibiooteilla. Tämä ensimmäinen seulonta mahdollistaa sellaisten kohteiden tunnistamisen ja poistamisen, jotka osoittavat osittaista vastetta, ja myöhemmän analyysin niistä, jotka osoittavat erilaisimmat vasteet. Vaihe 2 käsittää syvän nestekromatografian massaspektrometriaan (LC/MS/MS) perustuvan kvantitatiivisen analyysin yhdistetyistä näytteistä (3 poolia, jotka on muodostettu satunnaisesti kustakin vastekohortista) kustakin tunnistetusta vasteryhmästä. Molekyylejä, jotka osoittavat merkittäviä muutoksia, pidetään lääkevasteen biomarkkereina. Vaiheessa 3 kehitetään immunomäärityksiä (ELISA) testaamaan kunkin uuden biomarkkerin validiteettia sen kyvyssä erikseen tai yhdessä olemassa olevien biomarkkerien kanssa ennustaa lääkevastetta.

Immuunivaste: Kokoverinäytteitä inkuboidaan Mu-antigeenien kanssa yön yli 37 celsiusasteessa ja supernatantti varastoidaan sytokiinimäärityksiä varten ELISA:aa varten, kuten aikaisemmissa tutkimuksissamme (4).

Antigeenistimuloituja T-solupopulaatioita tutkitaan myös virtaussytometrialla interferonin (IFN) gamman, tuumorinekroositekijän (TNF) ja interleukiini-2:ta (IL2) erittävien T-solujen osuuden arvioimiseksi potilaissa verrokkeihin verrattuna.

Mykolaktonin havaitseminen: Lipidit uutetaan homogenoiduista ihobiopsioista ja vanupuikoista//hienoista neulaaspiraateista, ja mykolaktonin biologinen aktiivisuus mitataan sytotoksisuusmäärityksellä, kuten aiemmin on kuvattu käyttäen ihmisen alkion keuhkojen fibroblasteja kohdesoluina. Mykolaktonin läsnäolo kudosnäytteissä varmistetaan ja kvantifioidaan massaspektrometrialla, kuten aiemmin on kuvattu (5). Turvotusleesioista eristetyn Mu-kannan mykolaktonin tuotanto kvantifioidaan in vitro ja mykolaktonin kudoskonsentraatio edematous-leesioissa mitataan.

Otoskoko ja perustelut Tähän tutkimukseen osallistuu 450 osallistujaa. Aiemmat tutkimuksemme osoittivat, että TNF-alfan keskimääräinen ero lähtötilanteessa nopeiden ja hitaasti reagoivien potilaiden välillä oli 15 pg/ml ja standardipoikkeama 33 pg/ml. Standardoitu keskimääräinen ero laskettuna d=15/33 oli 0,45. Tämän eron havaitsemiseen tarvittava otoskoko 5 %:n kaksipuolisella merkityksellä ja 80 %:n teholla olisi 100 osallistujaa kussakin ryhmässä (200 potilasta). Odotamme 20 prosentin poistumisasteen nostaen otoskoon 250 potilaaseen. Mukana on 200 terveen vapaaehtoisen kontrolliryhmä

Tilastollinen analyysi Tässä tutkimuksessa "nopeasti reagoiva tai nopeasti reagoiva" määritellään potilaaksi, jonka paranemisaika on alle 12 viikkoa tai paranemisnopeus yli 4 mm/viikko ja "hidas reagoiva tai hidas paraneja" määritellään potilaaksi, jonka paranemisaika on vähintään 12 viikkoa tai paranemisnopeus alle 3 mm/viikko

Multianalyyttiprofiloinnin tuottamat tiedot analysoidaan monimuuttujaanalyysillä, mukaan lukien pääkomponenttianalyysi (PCA) ja osittaisten pienimmän neliösumman (PLS) menetelmät, käyttäen SIMCA 13 -ohjelmistoa (Umetrics, Ruotsi) . Yksimuuttujaanalyysejä tehdään ehdokkaiden biomarkkereiden karakterisoimiseksi edelleen. Tässä analysoidaan kontrollien ja sairauspotilaiden välisiä eroja käyttämällä ei-parametrista Wilcoxon ranksum (Mann-Whitney) -testiä. BUD-potilaiden parinäytteet viikolla 0 ja viikolla 12 verrataan käyttämällä Wilcoxon signed rank -testiä. Yksimuuttujaanalyysi ja useat testaussäädöt suoritetaan käyttämällä R-ohjelmistoa (versio 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Wien, Itävalta) ja pakettia QVALUE. Graafiseen esitykseen käytetään GraphPad Prism -ohjelmistoa.