Patogeneze a léčba M. Ulcerans Disease, Buruli Ulcer (Buruli_Path)

Postupy

Infikovaní účastníci

Po sběru demografických dat pomocí standardních formulářů Světové zdravotnické organizace (BU01) spolu s pečlivou anamnézou, aby bylo možné určit, kdy byly poprvé pozorovány rané léze (uzliny, plaky a vředy), bude typ a rozměry lézí zdokumentovány spolu s digitálními fotografiemi a trasováním. na acetátové listy. U edematózních lézí budou získány pouze digitální fotografie. Pacienti budou kontrolováni ve 2 týdenních intervalech během standardní antibiotické léčby (rifampicin 10 mg/kg a streptomycin 15 mg/kg) s dalšími záznamy klinických údajů, jak se to provádí u všech rutinních pacientů. Tato měření umožní výpočet rychlosti hojení a doby hojení ve vztahu k velikosti a typu léze. Pacienti budou sledováni kvůli paradoxním reakcím, které se objevují po zahájení léčby asi u 8 % pacientů. Tyto procedury jsou běžně poskytovány jako součást běžné péče o pacienty s buruli vředem.

Vzorky

Další vzorky požadované od pacientů pro studii jsou objem krve navíc (7 ml) a 3 výtěry odebrané příležitostně (na začátku, týden 4, 8, 12 a 16), pouze když má pacient v těchto časových bodech léze. K určení, zda jsou organismy detekované polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) stále životaschopné, jsou nutné výtěry/aspiráty tenkou jehlou, jeden pro kulturu M. ulcerans, jeden pro měření koncentrace mykolaktonu a jeden pro kombinovanou reverzní transkriptázu 16S ribozomální ribonukleové kyseliny (rRNA). / inzerční sekvence IS2404 Real-Time qPCR test (1).

U pacientů, u kterých se během terapie rozvinou paradoxní léze, bude v době reakce odebrán další vzorek krve a 3 výtěry/aspiráty tenkou jehlou pro markery životaschopnosti (kultura M. ulcerans, kombinovaná 16S rRNA reverzní transkriptáza / IS2404 kvantitativní polymerázový řetězec v reálném čase reakce (qPCR) a detekce mykolaktonu).

U edematózních lézí bude odebrán jeden výtěr/aspiráty jemné jehly pro detekci a kvantifikaci mykolaktonu z lézí, které jsou ulcerované. Biopsie o velikosti 3 mm bude provedena v lokální anestezii u neulcerovaných lézí za stejným účelem, pouze pokud je pacientovi 15 let nebo více.

Zavedenou praxí pro rutinní diagnostiku infekce M. ulcerans je odběr aspirátů jemnou jehlou z neulcerovaných lézí pro detekci acidorezistentních bacilů (AFB), kultivaci a PCR pro IS2404. Tento vzorek není dostatečně velký pro kvantifikaci mykolaktonu, což je důležitá součást výzkumu patogeneze edematózního onemocnění, které se často projevuje bez ulcerace. Výtěry se používají při diagnostice vředů.

Kontroly U pacientů v kontaktu s domácnostmi v endemických vesnicích a zdravých kontrol v neendemických vesnicích bude odebrán 7ml vzorek krve pro vyšetření proteinových biomarkerů pomocí testu Luminex, podskupin T buněk pomocí průtokové cytometrie a imunitních odpovědí pomocí testu ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). v testu plné krve pro srovnávací studie. Nebudou odebírány žádné tkáňové biopsie.

Definice paradoxní reakce Paradoxní reakce bude definována jako nárůst zánětlivých změn se zvětšením velikosti léze větším než 100 %, po počátečním zlepšení a zmenšení velikosti; a/nebo objevení se nových lézí po nebo během antimykobakteriální léčby.

Vyšetření Detekce pacientů s rychlou odezvou: Biomarkery, koncentrace tkáňového mykolaktonu a imunitní odpověď budou měřeny na začátku. Rychlost hojení bude odhadnuta zdokumentováním počáteční velikosti léze a doby do úplného zhojení jako dříve (2).

Detekce Mu: Homogenáty výtěrů budou naočkovány na svahy Lowenstein Jensen pro kultivaci a mikroskopie bude provedena na nátěrech obarvených Ziehl-Neelsen pro AFB. PCR pro IS2404 bude prováděna tak, jak bylo popsáno dříve (3).

Biomarkery:

Vzorky séra budou podrobeny multianalytnímu profilování pomocí multianalytního profilování Luminex k identifikaci markerů edematózního onemocnění, paradoxních reakcí a rychlých reagujících pacientů.

Použijeme také proteomiku založenou na hmotnostní spektrometrii ke generování dalších sérových/tkáňových biomarkerů pomocí třífázového přístupu. Nejprve použijeme frakcionaci vzorků a hmotnostní spektrometrii (matrix-asistovaná laserová desorpce/ionizace/doba letu/hmotnostní spektrometrie) ke stanovení míry variability proteomického složení ve vzorcích od subjektů léčených antibiotiky. Tento první screening umožní identifikaci a odstranění subjektů vykazujících částečnou odpověď a následnou analýzu těch, kteří vykazují nejvíce odlišné reakce. Stupeň 2 zahrnuje hloubkovou kapalinovou chromatografii hmotnostní spektrometrii (LC/MS/MS) založenou na kvantitativní analýze spojených vzorků (3 soubory generované náhodně z každé kohorty odpovědí) z každé z identifikovaných skupin odpovědí. Molekuly, které vykazují významné změny, budou považovány za kandidátní biomarkery lékové odpovědi. Ve fázi 3 budou vyvinuty imunotesty (ELISA), aby se otestovala platnost každého nového biomarkeru v jeho schopnosti samostatně nebo v kombinaci s existujícími biomarkery předpovídat odpověď na lék.

Imunitní odpověď: Vzorky plné krve budou inkubovány s Mu antigeny přes noc při 37 stupních Celsia a supernatant bude uložen pro cytokinové testy pomocí ELISA jako v našich předchozích studiích (4).

Antigenem stimulované populace T lymfocytů budou také studovány průtokovou cytometrií, aby se vyhodnotil podíl T lymfocytů vylučujících interferon (IFN) gama, tumor nekrotizující faktor (TNF) a interleukin-2 (IL2) u pacientů ve srovnání s kontrolami.

Detekce mykolaktonu: Lipidy budou extrahovány z homogenizovaných kožních biopsií a výtěrů//aspirátů jemnou jehlou a biologická aktivita mykolaktonu bude měřena testem cytotoxicity, jak bylo popsáno dříve, s použitím lidských embryonálních plicních fibroblastů jako cílových buněk. Přítomnost mykolaktonu ve vzorcích tkáně bude potvrzena a kvantifikována hmotnostní spektrometrií, jak bylo popsáno dříve (5). Produkce mykolaktonu kmenem Mu izolovaným z edematózních lézí bude kvantifikována in vitro a bude měřena tkáňová koncentrace mykolaktonu v edematózních lézích.

Velikost vzorku a zdůvodnění Této studie se zúčastní 450 účastníků. Naše předchozí studie ukázaly, že střední rozdíl v TNF alfa na začátku mezi rychle a pomalu reagujícími pacienty byl 15 pg/ml a standardní odchylka 33 pg/ml. Standardizovaný průměrný rozdíl vypočítaný jako d=15/33 byl 0,45. Velikost vzorku potřebná k detekci tohoto rozdílu s oboustrannou významností 5 % as 80 % silou by byla 100 účastníků v každé skupině (tedy 200 pacientů). Očekáváme míru opotřebení 20 %, čímž se velikost vzorku zvýší na 250 pacientů. Kontrolní skupina bude 200 zdravých dobrovolníků

Statistická analýza Pro účely této studie je „rychle reagující nebo rychle reagující“ pacient definován jako pacient s dobou hojení kratší než 12 týdnů nebo rychlostí hojení vyšší než 4 mm/týden a „pomalý nebo pomalý léčitel“ je definován jako pacient s dobou hojení 12 nebo více týdnů nebo rychlostí hojení menší než 3 mm/týden

Data generovaná multianalytním profilováním budou analyzována multivariační analýzou, včetně analýzy hlavních komponent (PCA) a metod souvisejících s částečnými nejmenšími čtverci (PLS), pomocí softwaru SIMCA 13 (Umetrics, Švédsko). Pro další charakterizaci kandidátních biomarkerů budou provedeny jednorozměrné analýzy. Zde budou rozdíly mezi kontrolami a nemocnými pacienty analyzovány pomocí neparametrického Wilcoxonova rank sum testu (Mann-Whitney). Párové vzorky pro pacienty s BUD v týdnu 0 a týdnu 12 budou porovnány pomocí Wilcoxonova znaménkového rank testu. Jednorozměrná analýza a vícenásobné testovací úpravy budou provedeny pomocí softwaru R (verze 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Vídeň, Rakousko) a balíčku QVALUE. Pro grafické znázornění bude použit software GraphPad Prism.