Патогенез и лечение болезни M. Ulcerans, язвы Бурули (Buruli_Path)

Процедуры

Зараженные участники

После сбора демографических данных с использованием стандартных форм Всемирной организации здравоохранения (BU01) вместе с тщательным сбором анамнеза, чтобы установить, когда впервые наблюдались ранние поражения (узелки, бляшки и язвы), тип и размеры поражений будут документированы вместе с цифровыми фотографиями и трассировкой. на ацетатные листы. Для отечных поражений будут получены только цифровые фотографии. Пациентов будут осматривать с интервалом в 2 недели во время стандартного лечения антибиотиками (рифампицин 10 мг/кг и стрептомицин 15 мг/кг) с дальнейшими записями клинических данных, как это делается для всех обычных пациентов. Эти измерения позволят рассчитать скорость заживления и время заживления в зависимости от размера и типа поражения. Пациенты будут находиться под наблюдением на предмет парадоксальных реакций, возникающих после начала лечения примерно у 8% пациентов. Эти процедуры обычно проводятся как часть рутинного ухода за пациентами с язвой Бурули.

Образцы

Дополнительные образцы, требуемые от пациентов для исследования, представляют собой дополнительный объем крови (7 мл) и 3 мазка, взятых время от времени (исходно, на 4-й, 8-й, 12-й и 16-й неделе) только тогда, когда у пациента имеется поражение в эти моменты времени. Мазки / аспираты тонкой иглой необходимы для определения жизнеспособности организмов, обнаруженных с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), один для культуры M.rickans, один для измерения концентрации миколактона и один для комбинированной обратной транскриптазы 16S рибосомальной рибонуклеиновой кислоты (рРНК). / последовательность вставки IS2404 Анализ количественной ПЦР в реальном времени (1).

Для пациентов, у которых развиваются парадоксальные поражения во время терапии, во время реакции будет получен дополнительный образец крови и 3 мазка/тонкоигольного аспирата на маркеры жизнеспособности (культура M.clearans, комбинированная обратная транскриптаза 16S рРНК / количественная полимеразная цепь IS2404 в реальном времени). анализ реакции (КПЦР) и обнаружение миколактонов).

Для отечных поражений будет получен один мазок/аспираты тонкой иглой для обнаружения и количественного определения миколактонов из изъязвленных поражений. Пункционная биопсия 3 мм будет выполняться под местной анестезией на неизъязвленных поражениях с той же целью только в том случае, если пациенту 15 лет или больше.

Общепринятой практикой рутинной диагностики инфекции, вызванной бактериями, вызванными M.clearans, является взятие аспиратов тонкой иглой из неизъязвленных поражений для выявления кислотоустойчивых бактерий (КУБ), посев и ПЦР на IS2404. Этот образец недостаточно велик для количественного определения миколактона, что является важной частью исследования патогенеза отечной болезни, которая часто протекает без изъязвления. Мазки используются для диагностики язв.

Контрольная группа Для домашних контактов пациентов в эндемичных деревнях и здоровых контролей в неэндемичных деревнях будет получен образец крови объемом 7 мл для исследования белковых биомаркеров с помощью анализа Luminex, субпопуляций Т-клеток с помощью проточной цитометрии и иммунных ответов с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). в анализе цельной крови для сравнительных исследований. Биопсии тканей не берутся.

Определение парадоксальной реакции Парадоксальная реакция будет определяться как увеличение воспалительных изменений с увеличением размера поражения более чем на 100%, после первоначального улучшения и уменьшения размера; и/или появление новых поражений после или во время антимикобактериального лечения.

Исследования Выявление быстро реагирующих: Биомаркеры, концентрация миколактонов в тканях и иммунный ответ будут измеряться на исходном уровне. Скорость заживления будет оцениваться путем документирования начального размера поражения и времени до полного заживления, как и ранее (2).

Обнаружение Mu: гомогенаты мазков будут инокулированы на склоны Lowenstein Jensen для посева, а микроскопия будет проведена на мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену, для КУМ. ПЦР для IS2404 будет проводиться, как описано ранее (3).

Биомаркеры:

Образцы сыворотки будут подвергнуты анализу мультианалитов с использованием мультианализа Luminex для выявления маркеров отечного заболевания, парадоксальных реакций и пациентов с быстрым ответом.

Мы также будем использовать протеомику на основе масс-спектрометрии для создания дополнительных биомаркеров сыворотки / ткани, используя трехэтапный подход. Сначала мы будем использовать фракционирование образцов и масс-спектрометрию (матричная лазерная десорбция/ионизация/времяпролетная/масс-спектрометрия), чтобы определить степень изменчивости протеомного состава в образцах, взятых у субъектов, которых лечили антибиотиками. Этот первый скрининг позволит идентифицировать и удалить субъектов, демонстрирующих частичный ответ, и последующий анализ тех, кто демонстрирует наиболее несопоставимые ответы. Этап 2 включает количественный анализ на основе глубокой жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ/МС/МС) объединенных образцов (3 пула, сформированных случайным образом из каждой ответившей когорты) из каждой из выявленных ответных групп. Молекулы, которые демонстрируют значительные изменения, будут рассматриваться как биомаркеры-кандидаты на ответ на лекарство. На этапе 3 будут разработаны иммуноанализы (ELISA) для проверки достоверности каждого нового биомаркера с точки зрения его способности отдельно или в сочетании с существующими биомаркерами прогнозировать ответ на лекарство.

Иммунный ответ: Образцы цельной крови будут инкубироваться с антигенами Mu в течение ночи при 37 градусах Цельсия, а супернатант будет храниться для анализа цитокинов с использованием ELISA, как и в наших предыдущих исследованиях (4).

Стимулированные антигеном популяции Т-клеток также будут изучаться с помощью проточной цитометрии для оценки доли интерферона (IFN) гамма, фактора некроза опухоли (TNF) и интерлейкина-2 (IL2), секретирующих Т-клетки у пациентов по сравнению с контрольной группой.

Обнаружение миколактона: липиды будут экстрагированы из гомогенизированных биопсий кожи и мазков//тонкоигольных аспиратов, а биологическая активность миколактона будет измерена с помощью анализа цитотоксичности, как описано ранее, с использованием фибробластов легких эмбрионов человека в качестве клеток-мишеней. Наличие миколактона в образцах тканей будет подтверждено и количественно определено с помощью масс-спектрометрии, как описано ранее (5). Продуцирование миколактона штаммом Mu, выделенным из отечных поражений, будет количественно определено in vitro, и будет измерена концентрация миколактона в тканях отечных поражений.

Размер выборки и обоснование В этом исследовании примут участие 450 человек. Наши предыдущие исследования показали, что средняя разница в TNF-альфа на исходном уровне между пациентами с быстрым и медленным ответом составила 15 пг/мл, а стандартное отклонение — 33 пг/мл. Стандартизированная средняя разница, рассчитанная как d=15/33, составила 0,45. Размер выборки, необходимый для обнаружения этой разницы с двусторонней значимостью 5% и мощностью 80%, будет составлять 100 участников в каждой группе (то есть 200 пациентов). Мы ожидаем, что коэффициент отсева составит 20%, в результате чего размер выборки составит 250 пациентов. Будет контрольная группа из 200 здоровых добровольцев.

Статистический анализ Для целей данного исследования «быстро реагирующий или быстро реагирующий» определяется как пациент со временем до заживления менее 12 недель или скоростью заживления более 4 мм в неделю, а «медленно реагирующий или медленно заживающий» определяется как определяется как пациент со временем до заживления 12 или более недель или скоростью заживления менее 3 мм/нед.

Данные, полученные в результате профилирования нескольких аналитов, будут проанализированы с помощью многомерного анализа, включая анализ основных компонентов (PCA) и методы, связанные с методом наименьших квадратов (PLS), с использованием программного обеспечения SIMCA 13 (Umetrics, Швеция). Для дальнейшей характеристики биомаркеров-кандидатов будет проведен однофакторный анализ. Здесь различия между контрольной группой и пациентами с заболеванием будут проанализированы с использованием непараметрического критерия суммы рангов Уилкоксона (Манна-Уитни). Парные образцы для пациентов с BUD на неделе 0 и неделе 12 будут сравниваться с использованием критерия знакового ранга Уилкоксона. Одномерный анализ и множественные корректировки тестирования будут выполняться с использованием программного обеспечения R (версия 2.13.2, основная группа разработчиков R, R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия) и пакета QVALUE. Программное обеспечение GraphPad Prism будет использоваться для графического представления.