Patogênese e Manejo da Doença M. Ulcerans, Úlcera de Buruli (Buruli_Path)

Procedimentos

Participantes infectados

Após a coleta de dados demográficos usando formulários padrão da Organização Mundial da Saúde (BU01), juntamente com uma história cuidadosa para estabelecer quando as lesões iniciais (nódulos, placas e úlceras) foram observadas pela primeira vez, o tipo e as dimensões das lesões serão documentados juntamente com fotografias digitais e traçados em folhas de acetato. Para lesões edematosas serão obtidas apenas fotografias digitais. Os pacientes serão revisados ​​em intervalos de 2 semanas durante o tratamento antibiótico padrão (rifampicina 10 mg/kg e estreptomicina 15 mg/kg) com registros adicionais de dados clínicos, como é feito para todos os pacientes de rotina. Essas medições permitirão o cálculo da taxa de cicatrização e do tempo de cicatrização em relação ao tamanho e tipo de lesão. Os pacientes serão monitorados quanto a reações paradoxais que ocorrem após o início do tratamento em cerca de 8% dos pacientes. Esses procedimentos são fornecidos rotineiramente como parte dos cuidados de rotina dos pacientes com úlcera de Buruli.

Amostras

As amostras adicionais necessárias dos pacientes para o estudo são um volume extra de sangue (7 ml) e 3 zaragatoas colhidas ocasionalmente (na linha de base, semanas 4, 8, 12 e 16) apenas quando o paciente apresenta uma lesão nestes momentos. Swabs/aspirados com agulha fina são necessários para determinar se os organismos detectados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ainda são viáveis, um para cultura de M. ulcerans, um para medição da concentração de micolactona e um para transcriptase reversa combinada de ácido ribonucléico ribossômico 16S (rRNA) / sequência de inserção IS2404 Ensaio qPCR em tempo real (1).

Para pacientes que desenvolverem lesões paradoxais durante a terapia, uma amostra de sangue adicional e 3 swabs/aspirados com agulha fina serão obtidos no momento da reação para marcadores de viabilidade (cultura de M. ulcerans, transcriptase reversa 16S rRNA combinada / cadeia de polimerase quantitativa IS2404 Real-Time (qPCR) e detecção de micolactona).

Para lesões edematosas, um swab/aspirado com agulha fina será obtido para detecção e quantificação de micolactonas de lesões ulceradas. Uma biópsia por punção de 3 mm será realizada sob anestesia local em lesões não ulceradas para o mesmo propósito somente quando o paciente tiver 15 anos ou mais.

A prática estabelecida para o diagnóstico de rotina da infecção por M. ulcerans é coletar aspirados com agulha fina de lesões não ulceradas para detecção, cultura e PCR do bacilo álcool-ácido resistente (BAAR) para IS2404. Esta amostra não é grande o suficiente para a quantificação de micolactona, uma parte importante da investigação da patogênese da doença edematosa que frequentemente se apresenta sem ulceração. Swabs são usados ​​no diagnóstico de úlceras.

Controles Para os contatos domiciliares de pacientes em aldeias endêmicas e controles saudáveis ​​em aldeias não endêmicas, uma amostra de sangue de 7 ml será obtida para investigar biomarcadores de proteínas pelo ensaio Luminex, subconjuntos de células T por citometria de fluxo e respostas imunes usando Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) em um ensaio de sangue total para estudos comparativos. Nenhuma biópsia de tecido será feita.

Definição de reação paradoxal Reação paradoxal será definida como aumento das alterações inflamatórias com aumento do tamanho da lesão maior que 100%, após melhora inicial e diminuição do tamanho; e/ou aparecimento de novas lesões após ou durante o tratamento antimicobacteriano.

Investigações Detecção de respondedores rápidos: Biomarcadores, concentração tecidual de micolactona e resposta imune serão medidos na linha de base. A taxa de cicatrização será estimada documentando o tamanho inicial da lesão e o tempo para completar a cicatrização como anteriormente (2).

Detecção de Mu: Os homogenatos de swabs serão inoculados nas encostas de Lowenstein Jensen para cultura e a microscopia será realizada em esfregaços corados por Ziehl-Neelsen para AFB. A PCR para IS2404 será realizada conforme descrito anteriormente (3).

Biomarcadores:

As amostras de soro serão submetidas a perfis de multianalitos usando o perfil de multianalitos Luminex para identificar marcadores de doença edematosa, reações paradoxais e respostas rápidas.

Também usaremos proteômica baseada em espectrometria de massa para gerar biomarcadores adicionais de soro/tecido, adotando uma abordagem de três estágios. Primeiramente usaremos fracionamento de amostras e espectrometria de massa (dessorção/ionização/tempo de voo/espectrometria de massa assistida por matriz) para determinar o grau de variabilidade da composição proteômica em amostras de indivíduos a serem tratados com antibióticos. Esta primeira triagem permitirá a identificação e remoção dos sujeitos que apresentam uma resposta parcial e posterior análise daqueles que apresentam as respostas mais díspares. O estágio 2 compreende uma análise quantitativa baseada em cromatografia líquida profunda (LC/MS/MS) de amostras agrupadas (3 conjuntos gerados aleatoriamente de cada coorte de resposta) de cada um dos grupos de resposta identificados. Moléculas que apresentarem mudanças significativas serão consideradas biomarcadores candidatos de resposta a drogas. No estágio 3, imunoensaios (ELISA) serão desenvolvidos para testar a validade de cada novo biomarcador em sua capacidade separadamente ou em combinação com biomarcadores existentes para prever a resposta ao medicamento.

Resposta imune: Amostras de sangue total serão incubadas com antígenos Mu durante a noite a 37 graus Celsius e o sobrenadante será armazenado para ensaios de citocinas usando ELISA como em nossos estudos anteriores (4).

Populações de células T estimuladas por antígeno também serão estudadas por citometria de fluxo para avaliar a proporção de Interferon (IFN) gama, fator de necrose tumoral (TNF) e células T secretoras de interleucina-2 (IL2) em pacientes em comparação com controles.

Detecção de micolactona: Os lipídios serão extraídos de biópsias de pele homogeneizadas e zaragatoas//aspirados com agulha fina e a atividade biológica da micolactona será medida por um ensaio de citotoxicidade conforme descrito anteriormente usando fibroblastos pulmonares embrionários humanos como células-alvo. A presença de micolactona em amostras de tecido será confirmada e quantificada por espectrometria de massa conforme descrito anteriormente (5). A produção de micolactona pela cepa de Mu isolada de lesões edematosas será quantificada in vitro e a concentração tecidual de micolactona em lesões edematosas será medida.

Tamanho da amostra e justificativa Haverá 450 participantes neste estudo. Nossos estudos anteriores mostraram uma diferença média no TNF alfa na linha de base entre os respondedores rápidos e lentos de 15pg/ml e um desvio padrão de 33pg/ml. A diferença média padronizada calculada como d=15/33 foi de 0,45. O tamanho da amostra necessário para detectar essa diferença com significância bilateral de 5% e poder de 80% seria de 100 participantes em cada grupo (esses 200 pacientes). Esperamos uma taxa de atrito de 20%, elevando o tamanho da amostra para 250 pacientes. Haverá um grupo de controle de 200 voluntários saudáveis

Análise estatística Para o propósito deste estudo, uma "resposta rápida ou resposta rápida" é definida como um paciente com um tempo de cicatrização inferior a 12 semanas ou taxa de cicatrização superior a 4 mm/semana e "resposta lenta ou cura lenta" é definido como um paciente com tempo de cicatrização de 12 ou mais semanas ou taxa de cicatrização inferior a 3 mm/semana

Os dados gerados pelo perfil multianalítico serão analisados ​​por análise multivariada, incluindo análise de componentes principais (PCA) e métodos relacionados aos mínimos quadrados parciais (PLS), usando o software SIMCA 13 (Umetrics, Suécia). Análises univariadas serão realizadas para caracterizar melhor os biomarcadores candidatos. Aqui, as diferenças entre controles e pacientes com a doença serão analisadas usando o teste não paramétrico Wilcoxon rank sum (Mann-Whitney). Amostras pareadas para pacientes com BUD na semana 0 e na semana 12 serão comparadas usando o teste de postos sinalizados de Wilcoxon. A análise univariada e os ajustes de testes múltiplos serão realizados usando o software R (versão 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria) e o pacote QVALUE. O software GraphPad Prism será usado para representação gráfica.