M. Ulcerans betegség, Buruli fekély patogenezise és kezelése (Buruli_Path)

Eljárások

Fertőzött résztvevők

A demográfiai adatok összegyűjtése után az Egészségügyi Világszervezet szabványos nyomtatványaival (BU01), valamint gondos anamnézissel, hogy megállapítsák, mikor észlelték először a korai elváltozásokat (gócok, plakkok és fekélyek), a léziók típusát és méreteit digitális fényképekkel és nyomkövetésekkel együtt dokumentálják. acetát lapokra. Az ödémás elváltozásokról csak digitális fényképek készülnek. A betegeket 2 hetes időközönként felülvizsgálják a standard antibiotikus kezelés során (rifampicin 10 mg/kg és streptomycin 15 mg/kg), a klinikai adatok további rögzítésével, ahogyan minden rutin betegnél történik. Ezek a mérések lehetővé teszik a gyógyulási sebesség és a gyógyulási idő kiszámítását a lézió méretétől és típusától függően. A betegek körülbelül 8%-ánál figyelni fogják a paradox reakciókat, amelyek a kezelés megkezdése után jelentkeznek. Ezeket az eljárásokat rutinszerűen a Buruli fekélyes betegek rutin ellátásának részeként végzik.

Minták

A betegektől a vizsgálathoz szükséges további minták egy extra vérmennyiség (7 ml) és 3 alkalmanként vett tampon (a kiinduláskor, a 4., 8., 12. és 16. héten), csak akkor, ha a betegnek ezekben az időpontokban elváltozása van. Tampon/finom tűszpirátum szükséges annak meghatározásához, hogy a polimeráz láncreakcióval (PCR) kimutatott organizmusok még életképesek-e, egyet a M. ulcerans tenyészethez, egyet a mikolaktonkoncentráció méréséhez, egyet pedig a kombinált 16S riboszomális ribonukleinsav (rRNS) reverz transzkriptázhoz. / beillesztési szekvencia IS2404 Real-Time qPCR vizsgálat (1).

Azoknál a betegeknél, akiknél paradox elváltozások alakulnak ki a terápia során, további vérmintát és 3 tampont/finom tűszpirátumot vesznek az életképességi markerek (M. ulcerans tenyészet, kombinált 16S rRNS reverz transzkriptáz / IS2404 Real-Time kvantitatív polimeráz lánc) vizsgálatakor. reakció (qPCR) vizsgálat és mikolakton kimutatás).

Oedemás elváltozások esetén egy pálcikát/finom tűt szívnak le a mikolakton kimutatására és a fekélyes léziók mennyiségi meghatározására. A 3 mm-es lyukasztásos biopsziát helyi érzéstelenítés mellett végezzük a nem fekélyes elváltozásokon ugyanebből a célból, ha a beteg 15 éves vagy idősebb.

Az M. ulcerans fertőzés rutin diagnosztizálásának bevett gyakorlata az, hogy a nem fekélyes léziókból finom tűvel szívják le a saválló bacillus (AFB) kimutatását, a tenyésztést és az IS2404 PCR-t. Ez a minta nem elég nagy a mikolakton mennyiségi meghatározásához, ami fontos része a gyakran fekélyesedés nélkül jelentkező ödémás betegség patogenezisének vizsgálatának. A tampont a fekélyek diagnosztizálására használják.

Kontrollok Az endémiás falvakban élő betegek háztartási kapcsolataihoz és a nem endémiás falvakban egészséges kontrollokhoz 7 ml-es vérmintát veszünk a fehérje biomarkerek Luminex vizsgálattal, a T-sejt-alcsoportok áramlási citometriával és az immunválaszok vizsgálata az Enzyme Linked Immunorbent Assay (ELISA) segítségével. teljes vérvizsgálatban összehasonlító vizsgálatokhoz. Nem vesznek szövetbiopsziát.

A paradox reakció meghatározása A paradox reakció a gyulladásos elváltozások növekedése a lézió méretének 100%-nál nagyobb növekedésével a kezdeti javulás és méretcsökkenés után; és/vagy új elváltozások megjelenése antimikobakteriális kezelést követően vagy alatt.

Vizsgálatok Gyorsan reagálók kimutatása: A biomarkereket, a szöveti mikolakton-koncentrációt és az immunválaszt a kiinduláskor mérik. A gyógyulás sebességét a lézió kezdeti méretének és a gyógyulás befejezéséhez szükséges idő dokumentálásával becsülik meg, mint korábban (2).

Mu kimutatása: A tamponhomogenizátumokat Lowenstein Jensen-lejtőkre oltják be tenyésztéshez, és mikroszkópos vizsgálatot végeznek Ziehl-Neelsen festett keneteken az AFB-hez. Az IS2404 PCR-jét a korábban leírtak szerint hajtjuk végre (3).

Biomarkerek:

A szérummintákat több analitból álló profilalkotásnak vetik alá a Luminex multianalit profilozással, hogy azonosítsák az ödémás betegség markereit, a paradox reakciókat és a gyors reagálásokat.

Tömegspektrometrián alapuló proteomikát is alkalmazunk további szérum/szövet biomarkerek előállításához, háromlépcsős megközelítést alkalmazva. Először mintafrakcionálást és tömegspektrometriát (mátrix-asszisztált lézeres deszorpció/ionizáció/repülési idő/tömegspektrometria) használunk, hogy meghatározzuk a proteomikus összetétel variabilitásának mértékét az antibiotikumokkal kezelendő alanyokból származó mintákban. Ez az első szűrés lehetővé teszi a részleges választ mutató alanyok azonosítását és eltávolítását, majd a legkülönbözőbb válaszokat mutató személyek későbbi elemzését. A 2. szakasz az egyesített minták mélyfolyadékkromatográfiás tömegspektrometrián (LC/MS/MS) alapuló kvantitatív elemzését tartalmazza (minden egyes válaszcsoportból véletlenszerűen generált 3 pool) az egyes azonosított válaszcsoportokból. Azokat a molekulákat, amelyek jelentős változásokat mutatnak, a gyógyszerválasz jelölt biomarkereinek tekintik. A 3. szakaszban immunoassay-t (ELISA) fejlesztenek ki annak érdekében, hogy teszteljék az egyes új biomarkerek érvényességét, külön-külön vagy a meglévő biomarkerekkel kombinálva a gyógyszerválasz előrejelzésére.

Immunreakció: A teljes vérmintákat Mu-antigénekkel inkubáljuk egy éjszakán át 37 Celsius-fokon, és a felülúszót tároljuk a citokin tesztekhez ELISA-t használva, mint korábbi vizsgálatainkban (4).

Az antigénekkel stimulált T-sejt-populációkat áramlási citometriával is vizsgálják, hogy felmérjék az interferon (IFN) gamma, a tumornekrózis faktor (TNF) és az interleukin-2 (IL2) szekretáló T-sejtek arányát a betegekben a kontrollokhoz képest.

Mikolakton kimutatása: A lipideket homogenizált bőrbiopsziákból és tamponokból//finom tűs aspirátumokból vonják ki, és a mikolakton biológiai aktivitását a korábban leírt citotoxicitási vizsgálattal mérik, humán embrionális tüdőfibroblasztok célsejtjeként. A mikolakton jelenlétét a szövetmintákban tömegspektrometriával kell megerősíteni és mennyiségileg meghatározni a korábban leírtak szerint (5). Az ödémás elváltozásokból izolált Mu törzs által termelt mikolakton mennyiségét in vitro mérik, és mérik a mikolakton szöveti koncentrációját ödémás elváltozásokban.

A minta mérete és indoklása Ebben a vizsgálatban 450 résztvevő vesz részt. Korábbi vizsgálataink azt mutatták, hogy a kiindulási TNF-alfa-értékben a gyors és lassú válaszadók közötti átlagos különbség 15 pg/ml, a standard eltérés pedig 33 pg/ml. A standardizált átlagos különbség d=15/33-ként 0,45 volt. Ennek a különbségnek a kimutatásához szükséges mintanagyság 5%-os kétoldali szignifikancia mellett 80%-os erővel 100 résztvevő lenne minden csoportban (ez 200 beteg). 20%-os lemorzsolódási arányra számítunk, így a minta mérete 250 betegre emelkedik. 200 egészséges önkéntesből álló kontrollcsoport lesz

Statisztikai elemzés Ebben a tanulmányban a "gyorsan reagáló vagy gyorsan reagáló" olyan pácienst jelent, akinek a gyógyulási ideje kevesebb, mint 12 hét, vagy a gyógyulási ráta meghaladja a 4 mm/hétet, és a "lassú reagálású vagy lassú gyógyulású" beteg. definíció szerint olyan beteg, akinek a gyógyulási ideje legalább 12 hét, vagy a gyógyulási ütem kevesebb, mint 3 mm/hét

A többelemes profilalkotással előállított adatokat többváltozós elemzéssel elemzik, beleértve a főkomponens-analízist (PCA) és a részleges legkisebb négyzetek (PLS) módszereit is, a SIMCA 13 szoftver (Umetrics, Svédország) segítségével. A jelölt biomarkerek további jellemzésére egyváltozós elemzéseket végeznek. Itt a kontrollok és a betegségben szenvedő betegek közötti különbségeket a nem-paraméteres Wilcoxon-rangösszeg (Mann-Whitney) teszttel elemezzük. A BUD-betegek páros mintáit a 0. és a 12. héten a Wilcoxon aláírt rangteszt segítségével hasonlítjuk össze. Az egyváltozós elemzést és a többszörös tesztelési kiigazításokat az R szoftver (2.13.2-es verzió, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Bécs, Ausztria) és a QVALUE csomag használatával hajtják végre. GraphPad Prism szoftvert használunk a grafikus ábrázoláshoz.