M. Ulcerans 질병, Buruli Ulcer의 병인 및 관리 (Buruli_Path)

절차

감염된 참가자

초기 병변(결절, 플라크 및 궤양)이 처음 관찰된 시기를 설정하기 위한 주의 깊은 이력과 함께 표준 세계 보건 기구 양식(BU01)을 사용하여 인구 통계학적 데이터를 수집한 후 병변의 유형 및 크기를 디지털 사진 및 추적과 함께 문서화합니다. 아세테이트 시트에. 부종성 병변의 경우 디지털 사진만 얻을 수 있습니다. 표준 항생제 치료(리팜피신 10mg/kg 및 스트렙토마이신 15mg/kg) 동안 2주 간격으로 환자를 검토하고 모든 일상적인 환자에 대해 임상 데이터를 추가로 기록합니다. 이러한 측정을 통해 병변 크기 및 유형과 관련하여 치유 속도 및 치유 시간을 계산할 수 있습니다. 환자의 약 8%에서 치료 시작 후 발생하는 역설적 반응에 대해 환자를 모니터링합니다. 이러한 절차는 Buruli 궤양 환자의 일상적인 치료의 일부로 정기적으로 제공됩니다.

견본

연구를 위해 환자에게 필요한 추가 샘플은 추가 혈액량(7ml)과 환자가 이러한 시점에 병변이 있는 경우에만 경우에 따라(기준선, 4주, 8주, 12주 및 16주) 채취한 3개의 면봉입니다. 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 검출된 유기체가 여전히 생존 가능한지 확인하기 위해 면봉/미세 바늘 흡인물이 필요합니다. 하나는 M. Ululans 배양용, 하나는 마이코락톤 농도 측정용, 다른 하나는 결합된 16S 리보솜 리보핵산(rRNA) 역전사 효소용입니다. /삽입 서열 IS2404 Real-Time qPCR 분석(1).

치료 중 역설적 병변이 발생하는 환자의 경우, 생존 마커(M. Ululans 배양, 결합된 16S rRNA 역전사 효소 / IS2404 실시간 정량적 폴리머라제 사슬 반응(qPCR) 분석 및 미코락톤 검출).

부종성 병변의 경우, 궤양이 있는 병변에서 미코락톤 검출 및 정량화를 위해 하나의 면봉/가는 바늘 흡인물을 채취합니다. 3mm 펀치 생검은 환자가 15세 이상인 경우에만 동일한 목적으로 궤양이 없는 병변에 국소 마취하에 시행됩니다.

M. Ulcerans 감염의 일상적인 진단을 위한 확립된 관행은 항산균(AFB) 검출, 배양 및 IS2404에 대한 PCR을 위해 비궤양성 병변에서 가는 바늘 흡인액을 채취하는 것입니다. 이 표본은 종종 궤양 없이 나타나는 부종성 질환의 병인에 대한 조사의 중요한 부분인 미코락톤 정량화를 수행하기에 충분히 크지 않습니다. 면봉은 궤양 진단에 사용됩니다.

컨트롤 풍토병 마을에 있는 환자의 가족 접촉자와 비엔데믹 마을의 건강한 대조군을 위해 7ml 혈액 샘플을 채취하여 Luminex 분석으로 단백질 바이오마커를 조사하고, 유세포 분석으로 T ​​세포 하위 집합을 조사하고, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 사용하여 면역 반응을 조사합니다. 비교 연구를 위한 전혈 분석에서. 조직 생검은 수행되지 않습니다.

역설적 반응의 정의 역설적 반응은 초기 호전 및 크기 감소 후 병변 크기가 100% 이상 증가하는 염증 변화의 증가로 정의됩니다. 및/또는 항마이코박테리아 치료 후 또는 도중에 새로운 병변의 출현.

조사 신속한 반응자 검출: 바이오마커, 조직 마이코락톤 농도 및 면역 반응을 기준선에서 측정합니다. 치유 속도는 병변의 초기 크기와 이전과 같이 치유가 완료되는 시간을 문서화하여 추정됩니다(2).

Mu의 검출: 면봉 균질물은 배양을 위해 Lowenstein Jensen 슬로프에 접종되고 현미경 검사는 AFB를 위해 Ziehl-Neelsen 염색 도말에서 수행됩니다. IS2404에 대한 PCR은 이전에 설명한 대로 수행됩니다(3).

바이오마커:

혈청 샘플은 부종성 질환, 역설적 반응 및 신속 반응자의 마커를 식별하기 위해 Luminex 다중 분석물 프로파일링을 사용하여 다중 분석물 프로파일링을 받게 됩니다.

우리는 또한 3단계 접근 방식을 취하는 추가 혈청/조직 바이오마커를 생성하기 위해 질량 분석 기반 프로테오믹스를 사용할 것입니다. 먼저 샘플 분류 및 질량 분석법(매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화/비행 시간/질량 분석법)을 사용하여 항생제로 치료할 피험자의 샘플에서 단백질 구성의 가변성 정도를 결정합니다. 이 첫 번째 스크리닝을 통해 부분 반응을 보이는 대상을 식별 및 제거하고 가장 이질적인 반응을 보이는 대상에 대한 후속 분석을 수행할 수 있습니다. 2단계는 식별된 각 응답 그룹에서 풀링된 샘플(각 응답 코호트에서 무작위로 생성된 3개의 풀)의 심층 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC/MS/MS) 기반 정량 분석으로 구성됩니다. 중요한 변화를 보이는 분자는 약물 반응의 후보 바이오마커로 간주됩니다. 3단계 면역분석법(ELISA)은 약물 반응을 예측하기 위해 개별적으로 또는 기존 바이오마커와 조합하여 각각의 새로운 바이오마커의 유효성을 테스트하기 위해 개발될 것입니다.

면역 반응: 전혈 샘플을 Mu 항원과 함께 섭씨 37도에서 밤새 배양하고 이전 연구에서와 같이 ELISA를 사용하여 사이토카인 분석을 위해 상층액을 보관합니다(4).

항원 자극 T 세포 집단은 또한 대조군과 비교하여 환자에서 인터페론(IFN) 감마, 종양 괴사 인자(TNF) 및 인터루킨-2(IL2) 분비 T 세포의 비율을 평가하기 위해 유동 세포측정법에 의해 연구될 것입니다.

미코락톤 검출: 균질화된 피부 생검 및 면봉//미세침 흡인물에서 지질을 추출하고 미코락톤의 생물학적 활성을 이전에 인간 배아 폐 섬유아세포를 표적 세포로 사용하여 설명한 세포독성 분석으로 측정합니다. 조직 샘플에서 미코락톤의 존재는 이전에 기술된 바와 같이 질량 분석법으로 확인되고 정량화됩니다(5). 부종성 병변으로부터 분리된 Mu 균주에 의한 미코락톤 생산은 시험관 내에서 정량화되고 부종성 병변에서 미코락톤의 조직 농도가 측정될 것이다.

샘플 크기 및 타당성 이 연구에는 450명의 참가자가 있을 것입니다. 우리의 이전 연구에서는 빠른 반응자와 느린 반응자 사이의 기준선에서 TNF 알파의 평균 차이가 15pg/ml이고 표준 편차가 33pg/ml인 것으로 나타났습니다. d=15/33으로 계산된 표준화 평균 차이는 0.45였습니다. 5%의 양측 유의성과 80% 검정력으로 이 차이를 감지하는 데 필요한 샘플 크기는 각 그룹의 참가자 100명(환자 200명)이 됩니다. 20%의 감소율을 예상하여 샘플 크기를 250명의 환자로 가져옵니다. 200명의 건강한 지원자로 구성된 대조군이 있을 것입니다.

통계 분석 이 연구의 목적을 위해 "신속한 반응자 또는 빠른 반응자"는 치유 시간이 12주 미만이거나 치유 속도가 4mm/주를 초과하는 환자로 정의되고 "느린 반응자 또는 느린 치유자"는 치유 시간이 12주 이상이거나 치유 속도가 주당 3mm 미만인 환자로 정의

다중 분석물 프로파일링으로 생성된 데이터는 SIMCA 13 소프트웨어(Umetrics, Sweden)를 사용하여 주성분 분석(PCA) 및 부분 최소 자승법(PLS) 관련 방법을 포함한 다변량 분석으로 분석됩니다. 후보 바이오마커를 더 특성화하기 위해 단변량 분석을 수행할 것입니다. 여기에서 비모수 Wilcoxon 순위 합계(Mann-Whitney) 테스트를 사용하여 대조군과 질병 환자 간의 차이를 분석합니다. 0주와 12주에 BUD 환자에 대한 쌍을 이룬 샘플은 Wilcoxon 부호 순위 테스트를 사용하여 비교됩니다. 단변량 분석 및 다중 테스트 조정은 R 소프트웨어(버전 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) 및 패키지 QVALUE를 사용하여 수행됩니다. GraphPad Prism 소프트웨어는 그래픽 표현에 사용됩니다.