Pathogenèse et prise en charge de la maladie de M. Ulcerans, ulcère de Buruli (Buruli_Path)

Procédures

Participants infectés

Après la collecte de données démographiques à l'aide des formulaires standard de l'Organisation mondiale de la santé (BU01) ainsi qu'un historique minutieux pour établir quand les lésions précoces (nodules, plaques et ulcères) ont été observées pour la première fois, le type et les dimensions des lésions seront documentés avec des photographies numériques et des tracés sur des feuilles d'acétate. Pour les lésions œdémateuses, seules des photographies numériques seront obtenues. Les patients seront revus toutes les 2 semaines pendant le traitement antibiotique standard (rifampicine 10 mg/kg et streptomycine 15 mg/kg) avec d'autres enregistrements des données cliniques, comme c'est le cas pour tous les patients de routine. Ces mesures permettront de calculer le taux de cicatrisation et le temps de cicatrisation en fonction de la taille et du type de lésion. Les patients seront surveillés pour des réactions paradoxales qui surviennent après le début du traitement chez environ 8 % des patients. Ces procédures sont systématiquement fournies dans le cadre des soins de routine des patients atteints d'ulcère de Buruli.

Échantillons

Les échantillons supplémentaires requis des patients pour l'étude sont un volume supplémentaire de sang (7 ml) et 3 écouvillons prélevés occasionnellement (au départ, semaines 4, 8, 12 et 16) uniquement lorsque le patient présente une lésion à ces moments précis. Des écouvillons/aspirations à l'aiguille fine sont nécessaires pour déterminer si les organismes détectés par réaction en chaîne par polymérase (PCR) sont toujours viables, un pour la culture de M. ulcerans, un pour la mesure de la concentration de mycolactone et un pour la transcriptase inverse combinée de l'acide ribonucléique ribosomal (ARNr) 16S / séquence d'insertion Test qPCR en temps réel IS2404 (1).

Pour les patients qui développent des lésions paradoxales pendant le traitement, un échantillon de sang supplémentaire et 3 écouvillons/aspirations à l'aiguille fine seront obtenus au moment de la réaction pour les marqueurs de viabilité (culture de M. ulcerans, transcriptase inverse d'ARNr 16S combinée / chaîne de polymérase quantitative en temps réel IS2404 test de réaction (qPCR) et détection de mycolactone).

Pour les lésions oedémateuses, un écouvillon/aspiration à l'aiguille fine sera obtenu pour la détection et la quantification de la mycolactone à partir des lésions ulcérées. Une biopsie à l'emporte-pièce de 3 mm sera réalisée sous anesthésie locale sur des lésions non ulcérées dans le même but uniquement lorsque le patient a 15 ans ou plus.

La pratique établie pour le diagnostic de routine de l'infection à M. ulcerans consiste à prélever des aspirations à l'aiguille fine à partir de lésions non ulcérées pour la détection, la culture et la PCR du bacille acido-résistant (AFB) pour IS2404. Cet échantillon n'est pas assez grand pour la quantification de la mycolactone, une partie importante de l'enquête sur la pathogenèse de la maladie œdémateuse qui se présente souvent sans ulcération. Les écouvillons sont utilisés dans le diagnostic des ulcères.

Contrôles Pour les contacts familiaux des patients dans les villages endémiques et les contrôles sains dans les villages non endémiques, un échantillon de sang de 7 ml sera obtenu pour étudier les biomarqueurs protéiques par dosage Luminex, les sous-ensembles de cellules T par cytométrie en flux et les réponses immunitaires à l'aide du dosage immuno-enzymatique (ELISA) dans un dosage sur sang total pour des études comparatives. Aucune biopsie tissulaire ne sera effectuée.

Définition de la réaction paradoxale La réaction paradoxale sera définie comme une augmentation des modifications inflammatoires avec augmentation de la taille de la lésion supérieure à 100 %, après amélioration initiale et diminution de la taille ; et/ou l'apparition de nouvelles lésions suite ou au cours d'un traitement antimycobactérien.

Investigations Détection des répondeurs rapides : Les biomarqueurs, la concentration tissulaire de mycolactone et la réponse immunitaire seront mesurés au départ. Le taux de guérison sera estimé en documentant la taille initiale de la lésion et le temps nécessaire pour terminer la guérison comme précédemment (2).

Détection de Mu : Les homogénats d'écouvillons seront inoculés sur des pentes de Lowenstein Jensen pour la culture et la microscopie sera effectuée sur des frottis colorés de Ziehl-Neelsen pour les BAAR. La PCR pour IS2404 sera réalisée comme décrit précédemment (3).

Biomarqueurs :

Les échantillons de sérum seront soumis à un profilage multi-analyte à l'aide du profilage multi-analyte Luminex pour identifier les marqueurs de la maladie œdémateuse, des réactions paradoxales et des répondeurs rapides.

Nous utiliserons également la protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour générer des biomarqueurs sériques/tissulaires supplémentaires en adoptant une approche en trois étapes. Dans un premier temps, nous utiliserons le fractionnement d'échantillons et la spectrométrie de masse (désorption laser assistée par matrice/ionisation/temps de vol/spectrométrie de masse) pour déterminer le degré de variabilité de la composition protéomique d'échantillons provenant de sujets à traiter avec des antibiotiques. Ce premier dépistage permettra l'identification et l'élimination des sujets présentant une réponse partielle et l'analyse ultérieure de ceux présentant les réponses les plus disparates. L'étape 2 comprend une analyse quantitative basée sur la spectrométrie de masse par chromatographie en phase liquide profonde (LC/MS/MS) d'échantillons regroupés (3 pools générés aléatoirement à partir de chaque cohorte de réponse) de chacun des groupes de réponse identifiés. Les molécules qui présentent des changements significatifs seront considérées comme des biomarqueurs candidats de la réponse aux médicaments. Au stade 3, des immunoessais (ELISA) seront développés afin de tester la validité de chaque nouveau biomarqueur dans sa capacité, séparément ou en combinaison avec des biomarqueurs existants, à prédire la réponse aux médicaments.

Réponse immunitaire : des échantillons de sang total seront incubés avec des antigènes Mu pendant la nuit à 37 degrés Celsius et le surnageant sera stocké pour des dosages de cytokines par ELISA, comme dans nos études précédentes (4).

Les populations de cellules T stimulées par l'antigène seront également étudiées par cytométrie en flux pour évaluer la proportion d'interféron (IFN) gamma, de facteur de nécrose tumorale (TNF) et de cellules T sécrétant de l'interleukine-2 (IL2) chez les patients par rapport aux témoins.

Détection de la mycolactone : les lipides seront extraits de biopsies cutanées homogénéisées et d'écouvillons // d'aspirations à l'aiguille fine et l'activité biologique de la mycolactone sera mesurée par un test de cytotoxicité tel que décrit précédemment en utilisant des fibroblastes pulmonaires embryonnaires humains comme cellules cibles. La présence de mycolactone dans les échantillons de tissus sera confirmée et quantifiée par spectrométrie de masse comme décrit précédemment (5). La production de mycolactone par la souche de Mu isolée des lésions oedémateuses sera quantifiée in vitro et la concentration tissulaire de mycolactone dans les lésions oedémateuses sera mesurée.

Taille de l'échantillon et justification Il y aura 450 participants à cette étude. Nos études précédentes ont montré une différence moyenne de TNF alpha au départ entre les répondeurs rapides et lents de 15pg/ml et un écart type de 33pg/ml. La différence moyenne standardisée calculée comme d = 15/33 était de 0,45. La taille d'échantillon requise pour détecter cette différence avec une signification bilatérale de 5 % et avec une puissance de 80 % serait de 100 participants dans chaque groupe (soit 200 patients). Nous prévoyons un taux d'attrition de 20% portant la taille de l'échantillon à 250 patients. Il y aura un groupe témoin de 200 volontaires sains

Analyse statistique Aux fins de cette étude, un « répondeur rapide ou répondeur rapide » est défini comme un patient avec un temps de guérison inférieur à 12 semaines ou un taux de guérison supérieur à 4 mm/semaine et « répondeur lent ou guérisseur lent » est défini comme un patient avec un délai de cicatrisation de 12 semaines ou plus ou un taux de cicatrisation inférieur à 3 mm/semaine

Les données générées par le profilage multianalyte seront analysées par analyse multivariée, y compris l'analyse en composantes principales (ACP) et les méthodes liées aux moindres carrés partiels (PLS), à l'aide du logiciel SIMCA 13 (Umetrics, Suède) . Des analyses univariées seront effectuées pour caractériser davantage les biomarqueurs candidats. Ici, les différences entre les témoins et les patients atteints de la maladie seront analysées à l'aide du test non paramétrique de la somme des rangs de Wilcoxon (Mann-Whitney). Des échantillons appariés pour les patients BUD à la semaine 0 et à la semaine 12 seront comparés à l'aide du test de rang signé de Wilcoxon. L'analyse univariée et les ajustements de tests multiples seront effectués à l'aide du logiciel R (version 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Vienne, Autriche) et du package QVALUE. Le logiciel GraphPad Prism sera utilisé pour la représentation graphique.