Patogenese og behandling af M. Ulcerans Sygdom, Buruli Ulcer (Buruli_Path)

Procedurer

Inficerede deltagere

Efter indsamling af demografiske data ved hjælp af standardformularer fra Verdenssundhedsorganisationen (BU01) sammen med en omhyggelig historik for at fastslå, hvornår tidlige læsioner (knuder, plaques og ulcera) først blev observeret, vil typen og dimensionerne af læsioner blive dokumenteret sammen med digitale fotografier og sporinger på acetatplader. For ødematøse læsioner vil der kun blive taget digitale fotografier. Patienterne vil blive gennemgået med 2 ugentlige intervaller under standard antibiotikabehandling (rifampicin 10 mg/kg og streptomycin 15 mg/kg) med yderligere registreringer af kliniske data, som det er gjort for alle rutinepatienter. Disse målinger vil muliggøre beregning af helingshastighed og helingstid i forhold til læsionsstørrelse og -type. Patienterne vil blive monitoreret for paradoksale reaktioner, der opstår efter behandlingsstart hos omkring 8 % af patienterne. Disse procedurer udføres rutinemæssigt som en del af rutinemæssig behandling af Buruli-sårpatienter.

Prøver

De yderligere prøver, der kræves fra patienter til undersøgelsen, er en ekstra mængde blod (7 ml) og 3 podninger taget ved lejligheder (ved baseline, uge ​​4, 8, 12 og 16), kun når patienten har en læsion på disse tidspunkter. Podninger/finnålsaspirater er nødvendige for at bestemme, om organismer påvist ved polymerasekædereaktion (PCR) stadig er levedygtige, én til M. ulcerans-kultur, én til måling af mycolactonkoncentration og én til kombineret 16S ribosomal ribonukleinsyre (rRNA) revers transkriptase / indsættelsessekvens IS2404 Real-Time qPCR-assay (1).

For patienter, der udvikler paradoksale læsioner under behandlingen, vil der blive udtaget en ekstra blodprøve og 3 podninger/finnålsaspirater på tidspunktet for reaktionen for levedygtighedsmarkører (M. ulcerans kultur, kombineret 16S rRNA revers transkriptase / IS2404 Real-Time kvantitativ polymerasekæde reaktion (qPCR) assay og mycolacton detektion).

For ødematøse læsioner opnås en podepind/finnålsaspirater til påvisning og kvantificering af mycolacton fra læsioner, der er ulcererede. En 3 mm punchbiopsi vil kun blive udført under lokalbedøvelse på ikke-ulcererede læsioner til samme formål, når patienten er 15 år eller derover.

Etableret praksis for rutinediagnosticering af M. ulcerans-infektion er at tage fine nålespirater fra ikke-ulcererede læsioner til syrefast bacillus (AFB) påvisning, dyrkning og PCR for IS2404. Denne prøve er ikke stor nok til mycolacton-kvantificering, en vigtig del af undersøgelsen af ​​patogenesen af ​​ødematøs sygdom, som ofte viser sig uden ulceration. Podninger bruges til diagnosticering af sår.

Kontroller Til husholdningskontakter for patienter i endemiske landsbyer og raske kontroller i ikke-endemiske landsbyer vil der blive udtaget en 7 ml blodprøve for at undersøge proteinbiomarkører ved Luminex-assay, T-celleundersæt ved flowcytometri og immunresponser ved hjælp af Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) i en fuldblodsanalyse til sammenlignende undersøgelser. Der vil ikke blive taget vævsbiopsier.

Definition af paradoksal reaktion Paradoksal reaktion vil blive defineret som en stigning i inflammatoriske forandringer med stigning i læsionsstørrelse på mere end 100 %, efter indledende forbedring og fald i størrelse; og/eller fremkomsten af ​​nye læsioner efter eller under antimykobakteriel behandling.

Undersøgelser Påvisning af hurtige respondere: Biomarkører, vævsmycolactonkoncentration og immunrespons vil blive målt ved baseline. Helingshastigheden vil blive estimeret ved at dokumentere den oprindelige størrelse af læsionen og tiden til fuldførelse af helingen som tidligere (2).

Påvisning af Mu: Podninger-homogenater vil blive podet på Lowenstein Jensen-skråninger til dyrkning og mikroskopi vil blive udført på Ziehl-Neelsen-farvede udstrygninger til AFB. PCR for IS2404 vil blive udført som beskrevet tidligere (3).

Biomarkører:

Serumprøver vil blive udsat for multianalytprofilering ved hjælp af Luminex multianalytprofilering for at identificere markører for ødematøs sygdom, paradoksale reaktioner og hurtige respondere.

Vi vil også bruge massespektrometri-baseret proteomik til at generere yderligere serum/vævsbiomarkører ved at tage en tre-trins tilgang. Først vil vi bruge prøvefraktionering og massespektrometri (matrix-assisteret laserdesorption/ionisering/flyvetid/massespektrometri) til at bestemme graden af ​​variabilitet af proteomisk sammensætning i prøver fra forsøgspersoner, der skal behandles med antibiotika. Denne første screening vil muliggøre identifikation og fjernelse af forsøgspersoner, der viser en delvis respons og efterfølgende analyse af dem, der viser de mest forskellige svar. Trin 2 omfatter en dyb væskekromatografi massespektrometri (LC/MS/MS)-baseret kvantitativ analyse af poolede prøver (3 pools genereret tilfældigt fra hver responskohorte) fra hver af de identificerede responsgrupper. Molekyler, der viser væsentlige ændringer, vil blive betragtet som kandidatbiomarkører for lægemiddelrespons. I trin 3 vil der blive udviklet immunoassays (ELISA) for at teste validiteten af ​​hver ny biomarkør i dens evne separat eller i kombination med eksisterende biomarkører til at forudsige lægemiddelrespons.

Immunrespons: Fuldblodsprøver vil blive inkuberet med Mu-antigener natten over ved 37 grader celsius, og supernatanten vil blive opbevaret til cytokinassays ved hjælp af ELISA som i vores tidligere undersøgelser (4).

Antigenstimulerede T-cellepopulationer vil også blive undersøgt ved flowcytometri for at vurdere andelen af ​​Interferon(IFN) gamma, Tumornekrosefaktor (TNF) og interleukin-2 (IL2) secernerende T-celler hos patienter sammenlignet med kontroller.

Påvisning af mycolacton: Lipider vil blive ekstraheret fra homogeniserede hudbiopsier og podninger//finnålsaspirater, og den biologiske aktivitet af mycolacton vil blive målt ved et cytotoksicitetsassay som beskrevet tidligere under anvendelse af humane embryonale lungefibroblaster som målceller. Tilstedeværelsen af ​​mycolacton i vævsprøver vil blive bekræftet og kvantificeret ved massespektrometri som tidligere beskrevet (5). Mycolactonproduktion af stammen af ​​Mu isoleret fra ødematøse læsioner vil blive kvantificeret in vitro, og vævskoncentrationen af ​​mycolacton i ødematøse læsioner vil blive målt.

Prøvestørrelse og begrundelse Der vil være 450 deltagere i denne undersøgelse. Vores tidligere undersøgelser viste en gennemsnitlig forskel i TNF-alfa ved baseline mellem hurtige og langsom respondere på 15 pg/ml og en standardafvigelse på 33 pg/ml. Den standardiserede middelforskel beregnet som d=15/33 var 0,45. Den nødvendige stikprøvestørrelse for at påvise denne forskel med en tosidet signifikans på 5 % og med 80 % kraft ville være 100 deltagere i hver gruppe (det vil sige 200 patienter). Vi forventer en nedslidningsrate på 20 %, hvilket bringer stikprøvestørrelsen op på 250 patienter. Der vil være en kontrolgruppe på 200 raske frivillige

Statistisk analyse Med henblik på denne undersøgelse er en "hurtig responder eller hurtig responder" defineret som en patient med en helingstid på mindre end 12 uger eller en helingshastighed på mere end 4 mm/uge og "langsom responder eller langsom healer" er defineret som en patient med tid til heling på 12 eller flere uger eller helingshastighed på mindre end 3 mm/uge

Data genereret ved multianalytprofilering vil blive analyseret ved multivariat analyse, herunder principal komponentanalyse (PCA) og partielle mindste kvadraters (PLS)-relaterede metoder, ved hjælp af SIMCA 13 softwaren (Umetrics, Sverige). Univariate analyser vil blive udført for yderligere at karakterisere kandidatbiomarkører. Her vil forskelle mellem kontroller og sygdomspatienter blive analyseret ved hjælp af den ikke-parametriske Wilcoxon rank sum (Mann-Whitney) test. Parrede prøver for BUD-patienter i uge 0 og uge 12 vil blive sammenlignet ved hjælp af Wilcoxon signed rank test. Univariat analyse og flere testjusteringer vil blive udført ved hjælp af R-software (version 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Wien, Østrig) og pakken QVALUE. GraphPad Prism software vil blive brugt til grafisk repræsentation.