Patogenesi e gestione della malattia di M. Ulcerans, ulcera di Buruli (Buruli_Path)

Procedure

Partecipanti infetti

Dopo la raccolta dei dati demografici utilizzando i moduli standard dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (BU01) insieme ad un'accurata anamnesi per stabilire quando le prime lesioni (noduli, placche e ulcere) sono state osservate per la prima volta, il tipo e le dimensioni delle lesioni saranno documentate insieme a fotografie digitali e tracciati su fogli di acetato. Per le lesioni edematose si otterranno solo fotografie digitali. I pazienti verranno rivisti a intervalli di 2 settimane durante il trattamento antibiotico standard (rifampicina 10 mg/kg e streptomicina 15 mg/kg) con ulteriori registrazioni di dati clinici come avviene per tutti i pazienti di routine. Queste misurazioni consentiranno di calcolare il tasso di guarigione e il tempo di guarigione in relazione alla dimensione e al tipo di lesione. I pazienti saranno monitorati per reazioni paradossali che si verificano dopo l'inizio del trattamento in circa l'8% dei pazienti. Queste procedure sono regolarmente fornite come parte della cura di routine dei pazienti con ulcera di Buruli.

Campioni

I campioni aggiuntivi richiesti ai pazienti per lo studio sono un volume extra di sangue (7 ml) e 3 tamponi prelevati occasionalmente (al basale, settimana 4, 8, 12 e 16) solo quando il paziente ha una lesione in questi punti temporali. Sono necessari tamponi/aspirato con ago sottile per determinare se i microrganismi rilevati dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) sono ancora vitali, uno per la coltura di M. ulcerans, uno per la misurazione della concentrazione di micolattone e uno per la trascrittasi inversa combinata dell'acido ribosomico ribonucleico (rRNA) 16S /sequenza di inserzione IS2404 Real-Time qPCR assay (1).

Per i pazienti che sviluppano lesioni paradossali durante la terapia, al momento della reazione per i marcatori di vitalità (coltura di M. ulcerans, combinata 16S rRNA trascrittasi inversa / IS2404 catena quantitativa della polimerasi in tempo reale) verranno prelevati un ulteriore campione di sangue e 3 tamponi/aspirato con ago sottile reazione (qPCR) e rilevazione del micolattone).

Per le lesioni edematose, sarà ottenuto un tampone/aspirato con ago sottile per il rilevamento e la quantificazione del micolattone dalle lesioni che sono ulcerate. Una biopsia del punch da 3 mm verrà eseguita in anestesia locale su lesioni non ulcerate per lo stesso scopo solo quando il paziente ha 15 anni o più.

La pratica consolidata per la diagnosi di routine dell'infezione da M. ulcerans consiste nel prelevare aspirati con ago sottile da lesioni non ulcerate per il rilevamento del bacillo acido-resistente (AFB), la coltura e la PCR per IS2404. Questo campione non è abbastanza grande per la quantificazione del micolattone, una parte importante dell'indagine sulla patogenesi della malattia edematosa che spesso si presenta senza ulcerazione. I tamponi sono utilizzati nella diagnosi delle ulcere.

Controlli Per i contatti familiari di pazienti in villaggi endemici e controlli sani in villaggi non endemici, sarà ottenuto un campione di sangue da 7 ml per studiare i biomarcatori proteici mediante saggio Luminex, sottogruppi di cellule T mediante citometria a flusso e risposte immunitarie utilizzando il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) in un test su sangue intero per studi comparativi. Non verranno prelevate biopsie tissutali.

Definizione di reazione paradossa La reazione paradossa sarà definita come un aumento dei cambiamenti infiammatori con aumento delle dimensioni della lesione superiore al 100%, dopo un miglioramento iniziale e una diminuzione delle dimensioni; e/o la comparsa di nuove lesioni dopo o durante il trattamento antimicobatterico.

Indagini Rilevazione di risposte rapide: i biomarcatori, la concentrazione di micolattone tissutale e la risposta immunitaria saranno misurati al basale. Il tasso di guarigione sarà stimato documentando la dimensione iniziale della lesione e il tempo per completare la guarigione come in precedenza (2).

Rilevazione di Mu: Gli omogenati dei tamponi saranno inoculati sui pendii di Lowenstein Jensen per la coltura e la microscopia sarà effettuata su strisci colorati di Ziehl-Neelsen per AFB. La PCR per IS2404 verrà eseguita come descritto in precedenza (3).

Biomarcatori:

I campioni di siero saranno sottoposti a profilazione multianalitica utilizzando la profilazione multianalitica Luminex per identificare marcatori di malattia edematosa, reazioni paradossali e risposte rapide.

Useremo anche la proteomica basata sulla spettrometria di massa per generare ulteriori biomarcatori sierici/tissutali adottando un approccio in tre fasi. In primo luogo utilizzeremo il frazionamento del campione e la spettrometria di massa (desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice/spettrometria a tempo di volo/massa) per determinare il grado di variabilità della composizione proteomica nei campioni di soggetti da trattare con antibiotici. Questo primo screening consentirà l'identificazione e l'allontanamento dei soggetti che mostrano una risposta parziale e la successiva analisi di quelli che mostrano le risposte più disparate. La fase 2 comprende un'analisi quantitativa basata sulla spettrometria di massa con cromatografia liquida profonda (LC/MS/MS) di campioni raggruppati (3 pool generati casualmente da ciascuna coorte di risposta) da ciascuno dei gruppi di risposta identificati. Le molecole che mostrano cambiamenti significativi saranno considerate come candidati biomarcatori di risposta ai farmaci. Nella fase 3 verranno sviluppati immunodosaggi (ELISA) per testare la validità di ciascun nuovo biomarcatore nella sua capacità separatamente o in combinazione con i biomarcatori esistenti di predire la risposta ai farmaci.

Risposta immunitaria: I campioni di sangue intero saranno incubati con antigeni Mu durante la notte a 37 gradi Celsius e il supernato sarà conservato per i saggi delle citochine usando ELISA come nei nostri studi precedenti (4).

Le popolazioni di cellule T stimolate dall'antigene saranno anche studiate mediante citometria a flusso per valutare la proporzione di cellule T che secernono interferone (IFN) gamma, fattore di necrosi tumorale (TNF) e interleuchina-2 (IL2) nei pazienti rispetto ai controlli.

Rilevamento del micolattone: I lipidi saranno estratti da biopsie cutanee omogeneizzate e tamponi//aspirati con ago sottile e l'attività biologica del micolactone sarà misurata mediante un test di citotossicità come descritto in precedenza utilizzando fibroblasti polmonari embrionali umani come cellule bersaglio. La presenza di micolattone nei campioni di tessuto sarà confermata e quantificata mediante spettrometria di massa come precedentemente descritto (5). La produzione di micolattone da parte del ceppo di Mu isolato da lesioni edematose sarà quantificata in vitro e sarà misurata la concentrazione tissutale di micolattone nelle lesioni edematose.

Dimensione del campione e giustificazione Ci saranno 450 partecipanti a questo studio. I nostri studi precedenti hanno mostrato una differenza media nel TNF alfa al basale tra i pazienti con risposta rapida e lenta pari a 15 pg/ml e una deviazione standard di 33 pg/ml. La differenza media standardizzata calcolata come d=15/33 era 0,45. La dimensione del campione richiesta per rilevare questa differenza con una significatività bilaterale del 5% e con una potenza dell'80% sarebbe di 100 partecipanti in ciascun gruppo (ovvero 200 pazienti). Prevediamo un tasso di abbandono del 20% portando la dimensione del campione a 250 pazienti. Ci sarà un gruppo di controllo di 200 volontari sani

Analisi statistica Ai fini di questo studio, si definisce "rapido o veloce" un paziente con un tempo di guarigione inferiore a 12 settimane o un tasso di guarigione superiore a 4 mm/settimana e "lento o lento guaritore" è definito come un paziente con un tempo di guarigione di 12 o più settimane o un tasso di guarigione inferiore a 3 mm/settimana

I dati generati dalla profilazione multianalitica saranno analizzati mediante analisi multivariata, inclusa l'analisi delle componenti principali (PCA) e metodi relativi ai minimi quadrati parziali (PLS), utilizzando il software SIMCA 13 (Umetrics, Svezia). Verranno eseguite analisi univariate per caratterizzare ulteriormente i biomarcatori candidati. Qui, le differenze tra controlli e pazienti con malattia saranno analizzate utilizzando il test non parametrico della somma dei ranghi di Wilcoxon (Mann-Whitney). I campioni accoppiati per i pazienti con BUD alla settimana 0 e alla settimana 12 verranno confrontati utilizzando il Wilcoxon Signed rank test. L'analisi univariata e gli aggiustamenti dei test multipli verranno eseguiti utilizzando il software R (versione 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) e il pacchetto QVALUE. Il software GraphPad Prism verrà utilizzato per la rappresentazione grafica.