Patogenese og behandling av M. Ulcerans sykdom, Buruli sår (Buruli_Path)

Prosedyrer

Infiserte deltakere

Etter innsamling av demografiske data ved bruk av standard skjemaer fra Verdens helseorganisasjon (BU01) sammen med en nøye historikk for å fastslå når tidlige lesjoner (knuter, plakk og sår) først ble observert, vil type og dimensjoner av lesjoner bli dokumentert sammen med digitale fotografier og sporinger på acetatplater. For ødematøse lesjoner vil kun digitale fotografier bli tatt. Pasienter vil bli gjennomgått med 2 ukentlige intervaller under standard antibiotikabehandling (rifampicin 10mg/kg og streptomycin 15mg/kg) med ytterligere registreringer av kliniske data som er gjort for alle rutinepasienter. Disse målingene vil muliggjøre beregning av tilhelingshastighet og tilhelingstid i forhold til lesjonsstørrelse og type. Pasientene vil bli overvåket for paradoksale reaksjoner som oppstår etter behandlingsstart hos ca. 8 % av pasientene. Disse prosedyrene utføres rutinemessig som en del av rutinemessig behandling av Buruli-sårpasienter.

Prøver

De ekstra prøvene som kreves fra pasienter for studien er et ekstra volum blod (7 ml) og 3 vattpinner tatt ved anledninger (ved baseline, uke 4, 8, 12 og 16) bare når pasienten har en lesjon på disse tidspunktene. Vatterpinner/finnålsaspirater kreves for å bestemme om organismer som er påvist ved polymerasekjedereaksjon (PCR) fortsatt er levedyktige, én for M. ulcerans-kultur, én for måling av mykolaktonkonsentrasjon og én for kombinert 16S ribosomal ribonukleinsyre (rRNA) revers transkriptase / innsettingssekvens IS2404 sanntids qPCR-analyse (1).

For pasienter som utvikler paradoksale lesjoner under behandlingen, vil det bli tatt en ekstra blodprøve og 3 vattpinner/finnålsaspirater på tidspunktet for reaksjonen for levedyktighetsmarkører (M. ulcerans kultur, kombinert 16S rRNA revers transkriptase / IS2404 sanntids kvantitativ polymerasekjede reaksjonsanalyse (qPCR) og mykolaktondeteksjon).

For ødematøse lesjoner vil en vattpinne/finnålsaspirater bli innhentet for mykolaktondeteksjon og kvantifisering fra lesjoner som er sår. En 3 mm stansebiopsi vil kun utføres under lokalbedøvelse på ikke-ulcererte lesjoner for samme formål når pasienten er 15 år eller eldre.

Etablert praksis for rutinemessig diagnose av M. ulcerans-infeksjon er å ta fine nålespirater fra ikke-ulcererte lesjoner for påvisning av syrefast basill (AFB), kultur og PCR for IS2404. Denne prøven er ikke stor nok for mykolaktonkvantifisering, en viktig del av undersøkelsen av patogenesen av ødematøs sykdom som ofte viser seg uten sårdannelse. Vatter brukes i diagnostisering av sår.

Kontroller For husholdningskontakter til pasienter i endemiske landsbyer og friske kontroller i ikke-endemiske landsbyer vil en 7 ml blodprøve bli innhentet for å undersøke proteinbiomarkører ved Luminex-analyse, T-celleundergrupper ved flowcytometri og immunresponser ved bruk av Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) i en fullblodsanalyse for komparative studier. Ingen vevsbiopsier vil bli tatt.

Definisjon av paradoksal reaksjon Paradoksal reaksjon vil defineres som en økning i inflammatoriske endringer med økning i lesjonsstørrelse på større enn 100 %, etter initial bedring og reduksjon i størrelse; og/eller opptreden av nye lesjoner etter eller under antimykobakteriell behandling.

Undersøkelser Påvisning av raske respondere: Biomarkører, vevsmykolaktonkonsentrasjon og immunrespons vil bli målt ved baseline. Tilhelingshastigheten vil bli estimert ved å dokumentere den opprinnelige størrelsen på lesjonen og tiden til full tilheling som tidligere (2).

Påvisning av Mu: Vatterhomogenater vil bli inokulert på Lowenstein Jensen-bakker for dyrking og mikroskopering vil bli utført på Ziehl-Neelsen-fargede utstryk for AFB. PCR for IS2404 vil bli utført som beskrevet tidligere (3).

Biomarkører:

Serumprøver vil bli gjenstand for multianalytprofilering ved bruk av Luminex multianalytprofilering for å identifisere markører for ødematøs sykdom, paradoksale reaksjoner og raske respondere.

Vi vil også bruke massespektrometri-basert proteomikk for å generere ytterligere serum/vevsbiomarkører ved å bruke en tre-trinns tilnærming. Først skal vi bruke prøvefraksjonering og massespektrometri (matriseassistert laserdesorpsjon/ionisering/flytid/massespektrometri) for å bestemme graden av variasjon av proteomisk sammensetning i prøver fra forsøkspersoner som skal behandles med antibiotika. Denne første screeningen vil tillate identifikasjon og fjerning av forsøkspersoner som viser en delvis respons og påfølgende analyse av de som viser de mest ulike responsene. Trinn 2 omfatter en dyp væskekromatografi massespektrometri (LC/MS/MS)-basert kvantitativ analyse av sammenslåtte prøver (3 pools generert tilfeldig fra hver responskohort) fra hver av de identifiserte responsgruppene. Molekyler som viser betydelige endringer vil bli vurdert som kandidatbiomarkører for medikamentrespons. I trinn 3 vil immunoassays (ELISA) utvikles for å teste gyldigheten til hver ny biomarkør i dens evne separat eller i kombinasjon med eksisterende biomarkører for å forutsi medikamentrespons.

Immunrespons: Fullblodsprøver vil bli inkubert med Mu-antigener over natten ved 37 grader celsius og supernatanten vil bli lagret for cytokinanalyser ved bruk av ELISA som i våre tidligere studier (4).

Antigenstimulerte T-cellepopulasjoner vil også bli studert ved flowcytometri for å vurdere andelen av Interferon(IFN) gamma, Tumornekrosefaktor (TNF) og interleukin-2 (IL2) utskillende T-celler hos pasienter sammenlignet med kontroller.

Mykolaktondeteksjon: Lipider vil bli ekstrahert fra homogeniserte hudbiopsier og vattpinner//finnålsaspirater og den biologiske aktiviteten til mykolakton vil bli målt ved en cytotoksisitetsanalyse som beskrevet tidligere ved bruk av humane embryonale lungefibroblaster som målceller. Tilstedeværelsen av mykolakton i vevsprøver vil bli bekreftet og kvantifisert ved massespektrometri som tidligere beskrevet (5). Mykolaktonproduksjon av stammen av Mu isolert fra ødematøse lesjoner vil kvantifiseres in vitro og vevskonsentrasjonen av mykolakton i ødematøse lesjoner vil bli målt.

Utvalgsstørrelse og begrunnelse Det vil være 450 deltakere i denne studien. Våre tidligere studier viste en gjennomsnittlig forskjell i TNF alfa ved baseline mellom raske og sakte respondere til å være 15 pg/ml og et standardavvik på 33 pg/ml. Den standardiserte gjennomsnittlige forskjellen beregnet som d=15/33 var 0,45. Prøvestørrelsen som kreves for å oppdage denne forskjellen med en tosidig signifikans på 5 % og med 80 % kraft vil være 100 deltakere i hver gruppe (det vil si 200 pasienter). Vi forventer en utmattelsesrate på 20 % som bringer prøvestørrelsen til 250 pasienter. Det vil være kontrollgruppe på 200 friske frivillige

Statistisk analyse For formålet med denne studien er en "rask responder eller rask responder" definert som en pasient med en tid til helbredelse på mindre enn 12 uker eller en tilhelingshastighet på mer enn 4 mm/uke og "sakte responder eller langsom healer" er definert som en pasient med tid til helbredelse på 12 eller flere uker eller tilhelingshastighet på mindre enn 3 mm/uke

Data generert ved multianalytprofilering vil bli analysert ved multivariat analyse, inkludert hovedkomponentanalyse (PCA) og partielle minste kvadraters (PLS)-relaterte metoder, ved bruk av SIMCA 13-programvaren (Umetrics, Sverige). Univariate analyser vil bli utført for å karakterisere kandidatbiomarkører ytterligere. Her vil forskjeller mellom kontroller og sykdomspasienter bli analysert ved hjelp av den ikke-parametriske Wilcoxon rank sum (Mann-Whitney) testen. Parede prøver for BUD-pasienter i uke 0 og uke 12 vil bli sammenlignet ved bruk av Wilcoxon signerte rangtest. Univariat analyse og flere testjusteringer vil bli utført ved hjelp av R-programvare (versjon 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Wien, Østerrike) og pakken QVALUE. GraphPad Prism programvare vil bli brukt for grafisk representasjon.