Pathogenese und Management der M. Ulcerans-Krankheit, Buruli Ulcer (Buruli_Path)

Verfahren

Infizierte Teilnehmer

Nach der Erfassung demografischer Daten unter Verwendung von Standardformularen der Weltgesundheitsorganisation (BU01) zusammen mit einer sorgfältigen Anamnese, um festzustellen, wann frühe Läsionen (Knötchen, Plaques und Geschwüre) zum ersten Mal beobachtet wurden, werden Art und Ausmaß der Läsionen zusammen mit digitalen Fotos und Aufzeichnungen dokumentiert auf Acetatplatten. Bei ödematösen Läsionen werden nur digitale Fotos erstellt. Die Patienten werden während der Standard-Antibiotikabehandlung (Rifampicin 10 mg/kg und Streptomycin 15 mg/kg) in 2-wöchigen Abständen mit weiteren Aufzeichnungen klinischer Daten überprüft, wie dies bei allen Routinepatienten der Fall ist. Diese Messungen ermöglichen die Berechnung der Heilungsrate und Heilungszeit in Bezug auf Läsionsgröße und -typ. Die Patienten werden auf paradoxe Reaktionen überwacht, die nach Beginn der Behandlung bei etwa 8 % der Patienten auftreten. Diese Verfahren werden routinemäßig als Teil der routinemäßigen Versorgung von Patienten mit Buruli-Ulkus durchgeführt.

Proben

Die zusätzlichen Proben, die von den Patienten für die Studie benötigt werden, sind ein zusätzliches Blutvolumen (7 ml) und 3 Abstriche, die gelegentlich (zu Studienbeginn, Woche 4, 8, 12 und 16) entnommen werden, nur wenn der Patient zu diesen Zeitpunkten eine Läsion hat. Abstriche/Feinnadelaspirate sind erforderlich, um zu bestimmen, ob durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesene Organismen noch lebensfähig sind, einer für die M. ulcerans-Kultur, einer für die Messung der Mykolactonkonzentration und einer für die kombinierte 16S-ribosomale Ribonukleinsäure (rRNA)-Reverse Transkriptase / Insertionssequenz IS2404 Real-Time qPCR-Assay (1).

Bei Patienten, die während der Therapie paradoxe Läsionen entwickeln, werden zum Zeitpunkt der Reaktion auf Viabilitätsmarker (M. ulcerans-Kultur, kombinierte 16S-rRNA-Reverse-Transkriptase/IS2404 Real-Time quantitative Polymerase-Kette) eine zusätzliche Blutprobe und 3 Abstriche/Feinnadelaspirate entnommen (qPCR)-Assay und Mycolacton-Nachweis).

Bei ödematösen Läsionen wird ein Abstrich/Feinnadelaspirat zum Mykolacton-Nachweis und zur Quantifizierung von ulzerierten Läsionen entnommen. Eine 3-mm-Stanzbiopsie wird unter örtlicher Betäubung an nicht ulzerierten Läsionen zum gleichen Zweck nur durchgeführt, wenn der Patient 15 Jahre oder älter ist.

Etablierte Praxis für die Routinediagnose einer M. ulcerans-Infektion ist die Entnahme von Feinnadelaspiraten aus nicht ulzerierten Läsionen zum Nachweis säurefester Bazillen (AFB), Kultur und PCR für IS2404. Diese Probe ist nicht groß genug für die Quantifizierung von Mykolacton, ein wichtiger Teil der Untersuchung der Pathogenese von Ödemerkrankungen, die oft ohne Ulzeration auftreten. Abstriche werden zur Diagnose von Geschwüren verwendet.

Kontrollen Für die Haushaltskontakte von Patienten in endemischen Dörfern und gesunden Kontrollen in nicht endemischen Dörfern wird eine 7-ml-Blutprobe entnommen, um Protein-Biomarker mit dem Luminex-Assay, T-Zell-Untergruppen mit Durchflusszytometrie und Immunantworten mit Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) zu untersuchen. in einem Vollbluttest für vergleichende Studien. Es werden keine Gewebebiopsien entnommen.

Definition der paradoxen Reaktion Eine paradoxe Reaktion wird definiert als eine Zunahme entzündlicher Veränderungen mit einer Zunahme der Läsionsgröße von mehr als 100 % nach anfänglicher Besserung und Abnahme der Größe; und/oder das Auftreten neuer Läsionen nach oder während einer antimykobakteriellen Behandlung.

Untersuchungen Nachweis von Rapid Respondern: Biomarker, Mykolactonkonzentration im Gewebe und Immunantwort werden zu Studienbeginn gemessen. Die Heilungsrate wird abgeschätzt, indem wie zuvor die anfängliche Größe der Läsion und die Zeit bis zur vollständigen Heilung dokumentiert werden (2).

Nachweis von Mu: Abstrichhomogenate werden auf Lowenstein-Jensen-Hänge für die Kultur geimpft, und Mikroskopie wird an Ziehl-Neelsen-gefärbten Abstrichen für AFB durchgeführt. Die PCR für IS2404 wird wie zuvor beschrieben durchgeführt (3).

Biomarker:

Serumproben werden einem Multi-Analyt-Profiling unter Verwendung von Luminex Multi-Analyt-Profiling unterzogen, um Marker für ödematöse Erkrankungen, paradoxe Reaktionen und schnelle Ansprecher zu identifizieren.

Wir werden auch Massenspektrometrie-basierte Proteomik verwenden, um zusätzliche Serum-/Gewebe-Biomarker in einem dreistufigen Ansatz zu generieren. Zunächst werden wir Probenfraktionierung und Massenspektrometrie (matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation/Flugzeit/Massenspektrometrie) verwenden, um den Grad der Variabilität der proteomischen Zusammensetzung in Proben von Probanden zu bestimmen, die mit Antibiotika behandelt werden sollen. Dieses erste Screening ermöglicht die Identifizierung und Entfernung von Probanden, die eine teilweise Reaktion zeigen, und die anschließende Analyse derjenigen, die die unterschiedlichsten Reaktionen zeigen. Stufe 2 umfasst eine auf Deep-Liquid-Chromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS/MS) basierende quantitative Analyse gepoolter Proben (3 zufällig aus jeder Reaktionskohorte generierte Pools) aus jeder der identifizierten Reaktionsgruppen. Moleküle, die signifikante Veränderungen zeigen, werden als mögliche Biomarker für das Ansprechen auf Medikamente betrachtet. In Stufe 3 werden Immunoassays (ELISA) entwickelt, um die Gültigkeit jedes neuen Biomarkers in seiner Fähigkeit zu testen, separat oder in Kombination mit bestehenden Biomarkern das Ansprechen auf Medikamente vorherzusagen.

Immunantwort: Vollblutproben werden mit Mu-Antigenen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert und der Überstand wird für Zytokin-Assays unter Verwendung von ELISA wie in unseren früheren Studien (4) aufbewahrt.

Antigen-stimulierte T-Zellpopulationen werden auch durch Durchflusszytometrie untersucht, um den Anteil von Interferon (IFN) gamma, Tumornekrosefaktor (TNF) und Interleukin-2 (IL2) sezernierenden T-Zellen bei Patienten im Vergleich zu Kontrollen zu bestimmen.

Mycolacton-Nachweis: Lipide werden aus homogenisierten Hautbiopsien und Abstrichen//Feinnadel-Aspiraten extrahiert und die biologische Aktivität von Mycolacton wird durch einen Zytotoxizitätstest, wie zuvor beschrieben, unter Verwendung von menschlichen embryonalen Lungenfibroblasten als Zielzellen gemessen. Das Vorhandensein von Mycolacton in Gewebeproben wird wie zuvor beschrieben durch Massenspektrometrie bestätigt und quantifiziert (5). Die Mycolactonproduktion durch den aus ödematösen Läsionen isolierten Mu-Stamm wird in vitro quantifiziert und die Gewebekonzentration von Mycolacton in ödematösen Läsionen wird gemessen.

Stichprobengröße und Begründung An dieser Studie werden 450 Teilnehmer teilnehmen. Unsere früheren Studien zeigten einen mittleren Unterschied in TNF alpha zu Studienbeginn zwischen schnell und langsam ansprechenden Personen von 15 pg/ml und eine Standardabweichung von 33 pg/ml. Die als d = 15/33 berechnete standardisierte mittlere Differenz betrug 0,45. Die erforderliche Stichprobengröße, um diesen Unterschied mit einer zweiseitigen Signifikanz von 5 % und einer Power von 80 % zu erkennen, wären 100 Teilnehmer in jeder Gruppe (dh 200 Patienten). Wir erwarten eine Fluktuationsrate von 20 %, wodurch sich die Stichprobengröße auf 250 Patienten erhöht. Es wird eine Kontrollgruppe von 200 gesunden Freiwilligen geben

Statistische Analyse Für die Zwecke dieser Studie ist ein „Rapid Responder oder Fast Responder“ definiert als ein Patient mit einer Zeit bis zur Heilung von weniger als 12 Wochen oder einer Heilungsrate von mehr als 4 mm/Woche und „Langsam Responder oder Slow Healer“. definiert als ein Patient mit einer Zeit bis zur Heilung von 12 oder mehr Wochen oder einer Heilungsrate von weniger als 3 mm/Woche

Daten, die durch Multianalyt-Profiling generiert werden, werden durch multivariate Analyse analysiert, einschließlich Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Methoden im Zusammenhang mit partiellen kleinsten Quadraten (PLS) unter Verwendung der Software SIMCA 13 (Umetrics, Schweden). Univariate Analysen werden durchgeführt, um mögliche Biomarker weiter zu charakterisieren. Hier werden Unterschiede zwischen Kontrollen und erkrankten Patienten mit dem nicht-parametrischen Wilcoxon-Rangsummentest (Mann-Whitney) analysiert. Gepaarte Proben für BUD-Patienten in Woche 0 und Woche 12 werden unter Verwendung des Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Tests verglichen. Univariate Analysen und mehrfache Testanpassungen werden mit der R-Software (Version 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österreich) und dem Paket QVALUE durchgeführt. Für die grafische Darstellung wird die Software GraphPad Prism verwendet.