Patogenes och hantering av M. Ulcerans sjukdom, Buruli sår (Buruli_Path)

Förfaranden

Infekterade deltagare

Efter insamling av demografisk data med hjälp av standardformulär från Världshälsoorganisationen (BU01) tillsammans med en noggrann historia för att fastställa när tidiga lesioner (knölar, plack och sår) först observerades, kommer typen och dimensionerna av lesioner att dokumenteras tillsammans med digitala fotografier och spårning på acetatark. För ödematösa lesioner erhålls endast digitala fotografier. Patienterna kommer att granskas med 2 veckovisa intervaller under standard antibiotikabehandling (rifampicin 10 mg/kg och streptomycin 15 mg/kg) med ytterligare registreringar av kliniska data som görs för alla rutinpatienter. Dessa mätningar kommer att möjliggöra beräkning av läkningshastighet och läkningstid i förhållande till skadans storlek och typ. Patienterna kommer att övervakas för paradoxala reaktioner som uppstår efter behandlingsstart hos cirka 8 % av patienterna. Dessa procedurer tillhandahålls rutinmässigt som en del av rutinvården av Buruli-sårpatienter.

Prover

De ytterligare prover som krävs från patienter för studien är en extra volym blod (7 ml) och 3 pinnar som tagits vid tillfällen (vid baslinjen, vecka 4, 8, 12 och 16) endast när patienten har en lesion vid dessa tidpunkter. Svabbar/finnålsaspirater krävs för att avgöra om organismer som detekteras med polymeraskedjereaktion (PCR) fortfarande är livskraftiga, en för M. ulcerans-odling, en för mätning av mykolaktonkoncentration och en för kombinerad 16S ribosomalt ribonukleinsyra (rRNA) omvänt transkriptas / insättningssekvens IS2404 Real-Time qPCR-analys (1).

För patienter som utvecklar paradoxala lesioner under behandlingen kommer ett extra blodprov och 3 pinnar/finnålsaspirater att tas vid tidpunkten för reaktionen för livskraftsmarkörer (M. ulcerans kultur, kombinerat 16S rRNA omvänt transkriptas / IS2404 realtids kvantitativ polymeraskedja reaktion (qPCR) analys och mykolaktondetektering).

För ödematösa lesioner erhålls en pinne/finnålsaspirat för att påvisa och kvantifiera mykolakton från lesioner som är sårbildade. En 3 mm stansbiopsi kommer att utföras under lokalbedövning på icke-ulcererade lesioner för samma ändamål endast när patienten är 15 år eller äldre.

Etablerad praxis för rutindiagnos av M. ulcerans-infektion är att ta fina nålspirater från icke-ulcererade lesioner för syrafast bacill (AFB) detektion, odling och PCR för IS2404. Detta prov är inte tillräckligt stort för mykolaktonkvantifiering, en viktig del av undersökningen av patogenesen av ödemsjukdom som ofta uppträder utan sårbildning. Svabbar används vid diagnos av sår.

Kontroller För hushållskontakter med patienter i endemiska byar och friska kontroller i icke-endemiska byar kommer ett 7 ml blodprov att tas för att undersöka proteinbiomarkörer med Luminex-analys, T-cellsundergrupper genom flödescytometri och immunsvar med hjälp av Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) i en helblodsanalys för jämförande studier. Inga vävnadsbiopsier kommer att tas.

Definition av paradoxal reaktion Paradoxal reaktion kommer att definieras som en ökning av inflammatoriska förändringar med en ökning i lesionsstorlek på mer än 100 %, efter initial förbättring och minskning i storlek; och/eller uppkomsten av nya lesioner efter eller under antimykobakteriell behandling.

Undersökningar Detektion av snabbresponderare: Biomarkörer, vävnadsmykolaktonkoncentration och immunsvar kommer att mätas vid baslinjen. Läkningshastigheten kommer att uppskattas genom att dokumentera den initiala storleken på lesionen och tiden till fullständig läkning som tidigare (2).

Detektering av Mu: Svabbarhomogenat kommer att inokuleras på Lowenstein Jensens sluttningar för odling och mikroskopi kommer att utföras på Ziehl-Neelsen-färgade utstryk för AFB. PCR för IS2404 kommer att utföras som beskrivits tidigare (3).

Biomarkörer:

Serumprover kommer att utsättas för multianalytprofilering med hjälp av Luminex multianalytprofilering för att identifiera markörer för ödematös sjukdom, paradoxala reaktioner och snabba svar.

Vi kommer också att använda masspektrometribaserad proteomik för att generera ytterligare serum/vävnadsbiomarkörer med en trestegsmetod. Först kommer vi att använda provfraktionering och masspektrometri (matrisassisterad laserdesorption/jonisering/flygtid/masspektrometri) för att bestämma graden av variabilitet av proteomisk sammansättning i prover från försökspersoner som ska behandlas med antibiotika. Denna första screening kommer att möjliggöra identifiering och avlägsnande av försökspersoner som visar ett partiellt svar och efterföljande analys av de som visar de mest olikartade svaren. Steg 2 omfattar en djup vätskekromatografi masspektrometri (LC/MS/MS)-baserad kvantitativ analys av poolade prover (3 pooler genererade slumpmässigt från varje svarskohort) från var och en av de identifierade svarsgrupperna. Molekyler som visar betydande förändringar kommer att betraktas som kandidatbiomarkörer för läkemedelssvar. I steg 3 kommer immunanalyser (ELISA) att utvecklas för att testa giltigheten av varje ny biomarkör i dess förmåga separat eller i kombination med befintliga biomarkörer för att förutsäga läkemedelssvar.

Immunsvar: Helblodsprover kommer att inkuberas med Mu-antigener över natten vid 37 grader celsius och supernatanten kommer att lagras för cytokinanalyser med ELISA som i våra tidigare studier (4).

Antigenstimulerade T-cellspopulationer kommer också att studeras med flödescytometri för att bedöma andelen interferon(IFN) gamma, tumörnekrosfaktor (TNF) och interleukin-2 (IL2) utsöndrande T-celler hos patienter jämfört med kontroller.

Mykolaktondetektering: Lipider kommer att extraheras från homogeniserade hudbiopsier och pinnprover//finnålsaspirater och den biologiska aktiviteten av mykolakton kommer att mätas med en cytotoxicitetsanalys som beskrivits tidigare med användning av humana embryonala lungfibroblaster som målceller. Förekomsten av mykolakton i vävnadsprover kommer att bekräftas och kvantifieras med masspektrometri som tidigare beskrivits (5). Mykolaktonproduktion av stammen av Mu isolerad från ödematösa lesioner kommer att kvantifieras in vitro och vävnadskoncentrationen av mykolakton i ödematösa lesioner kommer att mätas.

Provstorlek och motivering Det kommer att vara 450 deltagare i denna studie. Våra tidigare studier visade en genomsnittlig skillnad i TNF alfa vid baslinjen mellan snabba och långsamma svar på 15 pg/ml och en standardavvikelse på 33 pg/ml. Den standardiserade medelskillnaden beräknad som d=15/33 var 0,45. Den urvalsstorlek som krävs för att upptäcka denna skillnad med en dubbelsidig signifikans på 5 % och med 80 % kraft skulle vara 100 deltagare i varje grupp (det vill säga 200 patienter). Vi förväntar oss en förslitningsgrad på 20 %, vilket ger urvalsstorleken 250 patienter. Det kommer att finnas en kontrollgrupp på 200 friska frivilliga

Statistisk analys För syftet med denna studie definieras en "snabbreagerande eller snabbresponderare" som en patient med en läkningstid på mindre än 12 veckor eller en läkningshastighet på mer än 4 mm/vecka och "lågsamsvarare eller långsam läkande" är definieras som en patient med en läkningstid på 12 eller fler veckor eller en läkningshastighet på mindre än 3 mm/vecka

Data som genereras genom multianalytprofilering kommer att analyseras genom multivariat analys, inklusive principal komponentanalys (PCA) och partiella minsta kvadraters (PLS)-relaterade metoder, med hjälp av SIMCA 13-mjukvaran (Umetrics, Sverige). Univariata analyser kommer att utföras för att ytterligare karakterisera kandidatbiomarkörer. Här kommer skillnader mellan kontroller och sjukdomspatienter att analyseras med hjälp av det icke-parametriska Wilcoxon rank summa (Mann-Whitney) testet. Parade prover för BUD-patienter vid vecka 0 och vecka 12 kommer att jämföras med Wilcoxon signerade rangtest. Univariat analys och multipla testjusteringar kommer att utföras med R-programvara (version 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österrike) och paketet QVALUE. GraphPad Prism programvara kommer att användas för grafisk representation.