Patogeneza i leczenie choroby M. Wrzód, wrzód Buruli (Buruli_Path)

Procedury

Zainfekowani uczestnicy

Po zebraniu danych demograficznych przy użyciu standardowych formularzy Światowej Organizacji Zdrowia (BU01) wraz z dokładnym wywiadem w celu ustalenia, kiedy po raz pierwszy zaobserwowano wczesne zmiany (guzki, blaszki i owrzodzenia), rodzaj i wymiary zmian zostaną udokumentowane wraz ze zdjęciami cyfrowymi i wykresami na arkusze octanu. W przypadku zmian obrzękowych uzyskuje się wyłącznie zdjęcia cyfrowe. Pacjenci będą poddawani przeglądowi w 2 tygodniowych odstępach podczas standardowego leczenia antybiotykami (ryfampicyna 10 mg/kg i streptomycyna 15 mg/kg) z dalszymi zapisami danych klinicznych, tak jak ma to miejsce w przypadku wszystkich rutynowych pacjentów. Pomiary te umożliwią obliczenie tempa gojenia i czasu gojenia w zależności od wielkości i rodzaju zmiany. Pacjenci będą monitorowani pod kątem reakcji paradoksalnych, które występują po rozpoczęciu leczenia u około 8% pacjentów. Procedury te są rutynowo wykonywane w ramach rutynowej opieki nad pacjentami z wrzodem Buruli.

Próbki

Dodatkowe próbki wymagane od pacjentów do badania to dodatkowa objętość krwi (7 ml) i 3 wymazy pobierane okazjonalnie (na początku badania, w 4, 8, 12 i 16 tygodniu) tylko wtedy, gdy u pacjenta występuje zmiana chorobowa w tych punktach czasowych. Wymazy/cienkoigłowe aspiraty są wymagane do określenia, czy organizmy wykryte metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) są nadal żywe, jeden do hodowli M. wrzodowej, jeden do pomiaru stężenia mykolaktonu i jeden do połączonej odwrotnej transkryptazy rybosomalnego kwasu rybonukleinowego (rRNA) 16S / sekwencja insercyjna IS2404 Real-Time qPCR (1).

W przypadku pacjentów, u których podczas terapii wystąpią zmiany paradoksalne, zostanie pobrana dodatkowa próbka krwi i 3 wymazówki/aspiraty cienkoigłowe w czasie reakcji na markery żywotności (hodowla M. wrzodowa, połączona odwrotna transkryptaza 16S rRNA / ilościowy łańcuch polimerazy w czasie rzeczywistym IS2404 test reakcji (qPCR) i wykrywanie mikolaktonu).

W przypadku zmian obrzękowych należy pobrać jeden wymaz/aspirat cienkoigłowy w celu wykrycia mikolaktonu i oceny ilościowej zmian, które są owrzodzone. Biopsja 3 mm zostanie przeprowadzona w znieczuleniu miejscowym na nieowrzodzonych zmianach w tym samym celu tylko wtedy, gdy pacjent ma 15 lat lub więcej.

Ustaloną praktyką rutynowej diagnostyki zakażenia M. wrzodziejącym jest pobieranie aspiratów cienkoigłowych z nieowrzodzonych zmian w celu wykrycia, hodowli i PCR prątków kwasoodpornych (AFB) dla IS2404. Ta próbka nie jest wystarczająco duża do ilościowego oznaczenia mikolaktonu, co jest ważną częścią badania patogenezy choroby obrzękowej, która często objawia się bez owrzodzenia. Wymazy są stosowane w diagnostyce owrzodzeń.

Kontrole W przypadku kontaktów domowych pacjentów w wioskach endemicznych i zdrowych osób kontrolnych w wioskach nieendemicznych zostanie pobrana 7 ml próbka krwi w celu zbadania biomarkerów białkowych za pomocą testu Luminex, podzbiorów komórek T za pomocą cytometrii przepływowej i odpowiedzi immunologicznych za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) w badaniu krwi pełnej do badań porównawczych. Żadne biopsje tkanek nie będą pobierane.

Definicja reakcji paradoksalnej Reakcja paradoksalna będzie definiowana jako wzrost zmian zapalnych ze wzrostem wielkości zmiany o ponad 100%, po początkowej poprawie i zmniejszeniu wielkości; i/lub pojawienie się nowych zmian chorobowych po lub w trakcie leczenia przeciwprątkowego.

Badania Wykrywanie osób szybko reagujących: Biomarkery, tkankowe stężenie mikolaktonu i odpowiedź immunologiczna zostaną zmierzone na początku badania. Szybkość gojenia zostanie oszacowana poprzez udokumentowanie początkowej wielkości zmiany i czasu do całkowitego wygojenia, jak poprzednio (2).

Wykrywanie Mu: Homogenaty wymazów zostaną posiane na zboczach Lowenstein Jensen w celu hodowli, a rozmazy barwione metodą Ziehl-Neelsena zostaną przeprowadzone pod mikroskopem dla AFB. PCR dla IS2404 zostanie przeprowadzony jak opisano wcześniej (3).

Biomarkery:

Próbki surowicy zostaną poddane profilowaniu wieloanalitowemu przy użyciu profilowania wieloanalitowego Luminex w celu identyfikacji markerów choroby obrzękowej, reakcji paradoksalnych i osób szybko reagujących.

Wykorzystamy również proteomikę opartą na spektrometrii mas, aby wygenerować dodatkowe biomarkery surowicy/tkanki, stosując podejście trzyetapowe. W pierwszej kolejności wykorzystamy frakcjonowanie próbek i spektrometrię mas (desorpcja laserowa wspomagana matrycą/jonizacja/czas przelotu/spektrometria mas) do określenia stopnia zmienności składu proteomicznego próbek pobranych od osób leczonych antybiotykami. To pierwsze badanie przesiewowe pozwoli na identyfikację i usunięcie osób wykazujących częściową odpowiedź, a następnie analizę osób wykazujących najbardziej zróżnicowane odpowiedzi. Etap 2 obejmuje analizę ilościową zbiorczych próbek (3 pule wygenerowane losowo z każdej kohorty odpowiedzi) z każdej ze zidentyfikowanych grup odpowiedzi, opartą na analizie ilościowej opartej na chromatografii mas z głęboką chromatografią cieczową (LC/MS/MS). Cząsteczki wykazujące znaczące zmiany zostaną uznane za potencjalne biomarkery odpowiedzi na lek. Na etapie 3 zostaną opracowane testy immunologiczne (ELISA) w celu zbadania ważności każdego nowego biomarkera pod względem jego zdolności do przewidywania odpowiedzi na lek, oddzielnie lub w połączeniu z istniejącymi biomarkerami.

Odpowiedź immunologiczna: Próbki pełnej krwi będą inkubowane z antygenami Mu przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a supernatant będzie przechowywany do testów cytokinowych przy użyciu testu ELISA, tak jak w naszych poprzednich badaniach (4).

Populacje limfocytów T stymulowane antygenem będą również badane za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny proporcji limfocytów T wydzielających interferon (IFN) gamma, czynnik martwicy nowotworu (TNF) i interleukinę-2 (IL2) u pacjentów w porównaniu z grupą kontrolną.

Wykrywanie mikolaktonu: Lipidy zostaną wyekstrahowane z homogenizowanych biopsji skóry i wymazów//aspiratów cienkoigłowych, a aktywność biologiczna mykolaktonu zostanie zmierzona za pomocą testu cytotoksyczności, jak opisano wcześniej, przy użyciu ludzkich embrionalnych fibroblastów płucnych jako komórek docelowych. Obecność mykolaktonu w próbkach tkanek zostanie potwierdzona i określona ilościowo za pomocą spektrometrii mas, jak opisano wcześniej (5). Wytwarzanie mykolaktonu przez szczep Mu wyizolowany ze zmian obrzękowych będzie oznaczane ilościowo in vitro i mierzone będzie stężenie tkankowe mykolaktonu w zmianach obrzękowych.

Wielkość próby i uzasadnienie W badaniu weźmie udział 450 uczestników. Nasze poprzednie badania wykazały, że średnia różnica w wyjściowym stężeniu TNF alfa między osobami szybko i wolno reagującymi wynosiła 15 pg/ml, a odchylenie standardowe 33 pg/ml. Standaryzowana średnia różnica obliczona jako d=15/33 wynosiła 0,45. Wielkość próby wymagana do wykrycia tej różnicy przy dwustronnym znaczeniu 5% i mocy 80% wynosiłaby 100 uczestników w każdej grupie (czyli 200 pacjentów). Oczekujemy, że wskaźnik ścierania wyniesie 20%, co zwiększy wielkość próby do 250 pacjentów. Grupa kontrolna to 200 zdrowych ochotników

Analiza statystyczna Dla celów tego badania „osoba szybko reagująca lub osoba szybko reagująca” jest zdefiniowana jako pacjent z czasem do wyleczenia krótszym niż 12 tygodni lub szybkością gojenia większą niż 4 mm/tydzień, a „osoba szybko reagująca lub osoba szybko zdrowiejąca” to zdefiniowany jako pacjent, u którego czas do wygojenia wynosi 12 lub więcej tygodni lub tempo gojenia jest mniejsze niż 3 mm/tydzień

Dane wygenerowane przez profilowanie wielu analitów zostaną przeanalizowane za pomocą analizy wielowymiarowej, w tym analizy głównych składowych (PCA) i metod związanych z częściowymi najmniejszymi kwadratami (PLS), przy użyciu oprogramowania SIMCA 13 (Umetrics, Szwecja). Przeprowadzone zostaną analizy jednoczynnikowe w celu dalszego scharakteryzowania potencjalnych biomarkerów. W tym przypadku różnice między grupą kontrolną a pacjentami z chorobą zostaną przeanalizowane przy użyciu nieparametrycznego testu sumy rang Wilcoxona (Manna-Whitneya). Sparowane próbki pacjentów z BUD w tygodniu 0 i 12 zostaną porównane przy użyciu testu rang podpisanego Wilcoxona. Analiza jednowymiarowa i wiele korekt testów zostaną przeprowadzone przy użyciu oprogramowania R (wersja 2.13.2, R Development Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Wiedeń, Austria) i pakietu QVALUE. Do graficznej reprezentacji zostanie użyte oprogramowanie GraphPad Prism.