溃疡分枝杆菌病、布鲁里溃疡的发病机制和治疗 (Buruli_Path)

程序

受感染的参与者

在使用标准的世界卫生组织表格 (BU01) 收集人口统计数据并详细记录以确定首次观察到早期病变（结节、斑块和溃疡）的时间后，将记录病变的类型和大小以及数码照片和描记图到醋酸纤维板上。 对于水肿性病变，将仅获得数码照片。 在标准抗生素治疗（利福平 10mg/kg 和链霉素 15mg/kg）期间，将每 2 周对患者进行一次检查，并像对所有常规患者所做的那样进一步记录临床数据。 这些测量将能够计算与损伤大小和类型相关的愈合率和愈合时间。 将监测患者在开始治疗后约 8% 的患者出现的反常反应。 这些程序通常作为布鲁里溃疡患者常规护理的一部分提供。

样品

研究所需的患者额外样本是额外的血液量 (7ml) 和仅当患者在这些时间点有病变时才偶尔采集的 3 个拭子（在基线、第 4、8、12 和 16 周）。 需要拭子/细针抽吸物来确定通过聚合酶链反应 (PCR) 检测到的生物体是否仍然存活，一种用于溃疡分枝杆菌培养，一种用于测量分枝杆菌内酯浓度，一种用于组合 16S 核糖体核糖核酸 (rRNA) 逆转录酶/ 插入序列 IS2404 实时 qPCR 测定 (1)。

对于在治疗期间出现反常病变的患者，将在反应时获得额外的血样和 3 个拭子/细针抽吸物，用于生存力标记物（溃疡分枝杆菌培养物，结合 16S rRNA 逆转录酶/IS2404 实时定量聚合酶链反应（qPCR）测定和分枝杆菌内酯检测）。

对于水肿性病变，将获得一根拭子/细针抽吸物，用于检测溃疡性病变的支原体内酯和定量。 只有当患者年满 15 岁或以上时，才会在局部麻醉下对非溃疡病灶进行 3 毫米穿刺活检，目的相同。

常规诊断溃疡分枝杆菌感染的既定做法是从非溃疡性病变中抽取细针穿刺物进行抗酸杆菌 (AFB) 检测、培养和 IS2404 PCR。 该标本不够大，无法对支原体内酯进行定量，这是研究通常没有溃疡的水肿病发病机制的重要组成部分。 拭子用于诊断溃疡。

控制 对于地方病村庄患者的家庭接触者和非地方病村庄的健康对照，将获得 7ml 血样，通过 Luminex 测定研究蛋白质生物标志物，通过流式细胞术研究 T 细胞亚群，并使用酶联免疫吸附测定（ELISA）研究免疫反应在用于比较研究的全血测定中。 不会进行组织活检。

反常反应的定义 反常反应将被定义为在初始改善和缩小后，炎症变化增加，病变大小增加超过 100%；和/或在抗分枝杆菌治疗后或期间出现新病灶。

快速反应者的调查检测：将在基线测量生物标志物、组织分枝杆菌内酯浓度和免疫反应。 愈合率将通过记录损伤的初始大小和完成愈合的时间来估计，如前所述 (2)。

Mu 的检测：将拭子匀浆接种到 Lowenstein Jensen 斜坡上进行培养，并对 AFB 的 Ziehl-Neelsen 染色涂片进行显微镜检查。 IS2404 的 PCR 将如前所述 (3) 进行。

生物标志物：

将使用 Luminex 多分析物分析对血清样本进行多分析物分析，以确定水肿病、反常反应和快速反应者的标志物。

我们还将使用基于质谱的蛋白质组学，采用三阶段方法生成额外的血清/组织生物标志物。 首先，我们将使用样品分馏和质谱法（基质辅助激光解吸/电离/飞行时间/质谱法）来确定接受抗生素治疗的受试者样品中蛋白质组成分的变异程度。 第一次筛选将允许识别和移除显示部分响应的对象，并随后分析显示最不同响应的对象。 第 2 阶段包括基于深度液相色谱质谱法 (LC/MS/MS) 的定量分析，对来自每个已识别反应组的合并样本（从每个反应队列随机生成 3 个样本）进行定量分析。 表现出显着变化的分子将被视为药物反应的候选生物标志物。 在第 3 阶段，将开发免疫测定 (ELISA) 以测试每种新型生物标志物单独或与现有生物标志物结合预测药物反应的能力的有效性。

免疫反应：全血样本将与 Mu 抗原一起在 37 摄氏度下孵育过夜，并将上清液储存起来用于使用 ELISA 进行细胞因子测定，如我们之前的研究 (4) 所示。

还将通过流式细胞术研究抗原刺激的 T 细胞群，以评估与对照组相比，患者中干扰素 (IFN) γ、肿瘤坏死因子 (TNF) 和白细胞介素 2 (IL2) 分泌 T 细胞的比例。

霉菌内酯检测：从匀浆化的皮肤活组织检查和拭子//细针抽吸物中提取脂质，霉菌内酯的生物活性将通过细胞毒性测定来测量，如前所述，使用人胚胎肺成纤维细胞作为靶细胞。 如前所述 (5)，将通过质谱法确认和量化组织样品中霉菌内酯的存在。 分离自水肿病变的 Mu 菌株产生的霉菌内酯在体外进行定量，并测量水肿病变中霉菌内酯的组织浓度。

样本量和理由 本研究将有 450 名参与者。 我们之前的研究表明，快速反应者和慢反应者之间的基线 TNF α 平均差异为 15pg/ml，标准差为 33pg/ml。 计算为 d=15/33 的标准化平均差为 0.45。 以 5% 的双侧显着性和 80% 的功效检测这种差异所需的样本量为每组 100 名参与者（即 200 名患者）。 我们预计 20% 的流失率会使样本量达到 250 名患者。 将有200名健康志愿者组成的对照组

统计分析 出于本研究的目的，“快速反应者或快速反应者”被定义为愈合时间少于 12 周或愈合率大于 4 毫米/周的患者，“慢反应者或缓慢愈合者”被定义为定义为患者的愈合时间为 12 周或更长时间或愈合率低于 3 毫米/周

多分析物分析生成的数据将通过多变量分析进行分析，包括主成分分析 (PCA) 和偏最小二乘法 (PLS) 相关方法，使用 SIMCA 13 软件（瑞典 Umetrics）。 将进行单变量分析以进一步表征候选生物标志物。 在这里，将使用非参数 Wilcoxon 秩和 (Mann-Whitney) 检验分析对照和疾病患者之间的差异。 BUD 患者在第 0 周和第 12 周的配对样本将使用 Wilcoxon 符号秩检验进行比较。 将使用 R 软件（2.13.2 版，R 开发核心团队，R 统计计算基金会，奥地利维也纳）和 QVALUE 包进行单变量分析和多项测试调整。 GraphPad Prism 软件将用于图形表示。