ドライアイ患者の眼表面マイクロバイオーム

眼球表面は目の防御の最前線であるため、外部の脅威が感知され、潜在的な侮辱が中和される場所です。 進化の過程で、さまざまな微生物、特にバクテリアが共生生物として眼球表面に定着するようになりました。 共生生物は、眼球表面の恒常性を維持する役割を持っています。 1 眼表面の自然免疫は非常に活発で、炎症を抑える能動的なメカニズムで構成されています 2. 例えば、マクロファージ、樹状細胞、抑制細胞、制御細胞、B細胞、IgA、リゾチーム、抗菌ペプチド、外部エージェントに対する障壁。 眼表面の正常な共生生物は、眼表面上皮細胞上のパターン認識受容体を刺激することにより、自然防御の活性化の基礎レベルを維持します。 微生物のこの正常な構成は重要です。なぜなら、細菌叢を克服する病原性株の導入がある場合、または優性株が過剰に免疫原性産物を分泌する場合、例えば辺縁角膜炎を引き起こすブドウ球菌の外毒素 A IV型過敏症の。 フローラ負荷が高いほど、ムチン分解の増加 3 と球状細胞密度の低下 4 に関連することが判明したため、マイクロバイオームのフローラ負荷も涙液機能に影響を与える可能性があります。微生物の重要性を指摘します。 例えば、ドライアイ患者では、涙液中のリゾリン脂質が増加しており、これがアラキドン酸やその他の代謝産物などの炎症メディエーターに寄与している可能性があります。 リゾリン脂質はホスホリパーゼA2反応によって形成され、後者は微生物起源である可能性があります。 ドライアイは眼表面の炎症性疾患として知られているため、これは微生物が病状に寄与する 1 つの方法です。

マイクロバイオームは、身体の場所で見つかった微生物の総計です。 目のマイクロバイオームは、目の表面のアクセス可能な場所のため、非侵襲的に調査できます。 眼表面マイクロバイオームの重要性にもかかわらず、このトピックの理解は非常に表面的であり、主に培養方法に基づいています5-10. 一部の微生物はルーチンの細胞培養にあまり適しておらず、それらの存在が検出されないか、それらの表現が過小評価される可能性があるため、これは誤解を招く可能性があります 11. 最近開発されたメタゲノミクス シーケンスは、文化と比較して、マイクロバイオームの偏りのない見方を得るのに有利です11。

以前の 3 つの研究では、16s rRNA のメタゲノミクス シーケンスを使用して、眼表面のマイクロバイオーム プロファイルが評価されています 4、12、13。 ドライアイまたは眼瞼炎の被験者と健康な被験者の間でマイクロバイオームの違いが観察されました。 さらに、細菌培養に基づく結果と比較して、はるかに多様な眼球菌叢が発見されました。

南洋理工大学の化学・環境生命科学部は、このような技術を使用してマイクロバイオームを評価しました。 これの基礎は、原核生物は、典型的には起源の種を特徴づけることができる独特のDNAサインを持っており、異なる種の生物の相対的有病率は、検出された異なるDNAの相対的存在量から推定できるということです。 グローバル ヒューマン マイクロバイオーム プロジェクトは、人体のさまざまな部分のマイクロバイオームを理解しようとしています。 これは腸で最もよく理解されていますが、眼球表面に関する出版物はまだ出ていません。

最近、私たちの共同研究者は、3 つのバクテリアが眼球表面を支配していることを発見しました。 これらは肺炎桿菌、シュードアルテロモナス・アガリボランスおよびラクトバチルス・ラムノサスである。 この 3 種類の細菌の優位性は予想外でした。なぜなら、眼表面共生生物の支配的な見解は、コアグラーゼ陰性のブドウ球菌が優勢であり、続いて黄色ブドウ球菌と連鎖球菌が優勢であり、グラム陰性菌が少なく、いくつかのプロピオニバクター spp 11 が続くからです。 3 種のうち、クレブシエラ・ニューモニアは、感染性角膜炎、場合によっては眼内炎を引き起こす可能性がある既知のグラム陰性病原体です。 Pseudoalteromonas と Lactobacillus の役割は完全に不明です。 前者は、海洋環境に存在することが知られている非病原性の生きたグラム陰性菌です。 驚くべきことに、3 つの優勢な細菌の高レベルは 3 人の参加者の間で比較的一定しており、非罹患者の主要な細菌微生物による眼表面のコロニー形成にある程度の均一性があることを示唆しています。

眼球表面マイクロバイオームは、結膜の下円蓋の無菌スワッピングとそれに続くホモジナイゼーションおよび DNA の抽出によって調べることができます。 細菌の DNA の存在は、微生物の機能についてはわかりません。なぜなら、死んでいて増殖していない生物でさえ、残存 DNA を持っているからです。 サンプルを収集する手法でも RNA を得ることができ、逆転写 PCR から、眼球表面に見られる特定の微生物転写産物の存在を確認することができます。 さらに、Nanyang Polytechnic の協力者は、独自の細菌ペプチド配列の同定に基づいて、細菌プロテオームの特徴付けを可能にする MALDI TOF 質量分析技術を開発しました。 一緒に、これらの細菌転写およびタンパク質調査の技術により、遺伝子発現の評価と、発見された細菌の機能状態をある程度評価することができます。 これは、目の表面で以前に発見されていない微生物の場合に非常に重要です。

学術的および科学的な明らかな進歩とは別に、このプロジェクトには医学的意味合いと、商業的応用のための新しい知的財産の可能性もあります。 まず、マイクロバイオームの理解は、辺縁性角膜炎や異常な感染性角膜炎などの特定の種類の疾患を治療するための最初のステップです。 これは、治療のために免疫系をどのように操作できるかを示唆しています。 第二に、病気や炎症の予防は、生きている微生物をプロバイオティックに投与して眼球表面にコロニーを形成することによって達成される可能性があります。 第三に、この研究は、臨床診断アッセイに発展できる微生物とその成分を特定する新しい技術とアッセイにつながる可能性があります。

これらのアイデアのいくつかを開発するために私たちと提携することに興味を持っている業界の協力者が何人かいます。

1. 目的

私たちは、以下の探索的研究を行うことを目指しています。

1. 正常なボランティアとドライアイ患者の眼球表面の細菌マイクロバイオームの組成を決定する
2. 人間の眼球表面に見られる細菌の遺伝子発現 (細菌の転写物) を決定します。
3. 年齢、涙液層の状態、マイボーム腺の機能不全、喫煙などの環境刺激への曝露などの臨床的特徴に関連するマイクロバイオームの特徴を特徴付けます。

2. 予想されるリスクと利点 予想されるリスク この研究では潜在的な問題は予想されません。 ただし、結膜円蓋下部からのマイクロバイオームの収集中に、わずかな不快感があります。 不快感を最小限に抑えるために、非防腐剤のテトラカインが患者に投与されます。 また、Schimers I のテスト中に若干の不快感が生じる場合があります。

潜在的な利点 眼球表面のさまざまなマイクロバイオームの存在をより深く理解することで、起こっている複雑なプロセスについてさらに洞察を得ることができます。

3. 研究対象集団 3.1. 登録する科目の数と性質をリストします。 SNECドライアイクリニックおよび主任研究者がサービスを提供する一般クリニックから90人の被験者が募集されます。 ドライアイ症状のない 45 人の被験者を正常対照として募集し、症状のあるドライアイの 45 人の被験者をドライアイ被験者として募集します。

3.2. 採用基準と採用プロセス

1. 正常なコントロールを募集するには - ドライアイの症状に関する 8 つの質問はすべて、事前スクリーニング段階でドライアイの症状をクリアする必要があります。 (付録 1) Schein et al.,1997 に従って修正されたアンケート。 ドライアイの被験者を募集するには - ドライアイの症状に関する 8 つの質問のうち少なくとも 1 つがグレード 3 以上である必要があります。
2. 被験者は、以下にリストされているすべての包含基準を満たしています。
3. 除外基準をクリア。 被験者を募集する前に主治医に許可を求めます。 適格な被験者は、研究コーディネーターによって研究についてカウンセリングを受けます。 被験者が興味を持っている場合、研究コーディネーターは、関連する評価のために SERI レベル 5 に被験者を同行させます。 すべての参加者から書面によるインフォームド コンセントが得られます。

3.3.包含基準

-被験者は、この研究に参加するためのすべての選択基準を満たす必要があります。

1. 被験者は21歳以上でなければなりません
2. -この研究ですべての目の検査を喜んで行う

3.4。除外基準

ベースラインで除外基準のいずれかを満たすすべての被験者は、参加から除外されます。

1. -甲状腺障害の既知の病歴（医師による診断）。
2. -シェーグレン症候群または関節リウマチの既知の病歴（医師による診断）。
3. 過去 3 か月以内に眼科手術を受けておらず、1 年以内にレーシックを受けた。
4. 翼状片などの眼表面疾患、またはウサギ眼球を伴う明らかな眼瞼/眼窩疾患。
5. -臨床研究者によって決定されたその他の特定の理由。

4. 研究デザインと手順/方法論

研究デザイン:

観察 -横断研究

訪問回数:

この研究では1回のみの訪問があります。

学習期間:

1年

手順:

病歴の収集とドライアイアンケート 病歴と、コンタクトレンズの使用、喫煙、職業などの要因を特定するドライアイアンケートの標準セットで構成されるアンケートがあります。

非侵襲的涙液分解時間 (OCULUS K5M) 非侵襲的涙液分解時間は、OCULUS K5M を使用して非侵襲的かつ完全に自動的に測定されます。 新しい赤外線照明は人間の目には見えません。 これにより、検査中のまぶしさを防ぎます。 患者は器具の前に快適に座り、目の前のターゲットを見つめながら自由にまばたきします。 参加者の準備が整うと、2 回点滅し、点滅を控えるように指示されます。 ケラトグラフ 5M は完全に自動化されており、画像の切れ目やゆがみをキャプチャし、切れ目が記録されます。 平均値を得るために、それぞれの眼について 3 回の読み取りが行われます。

結膜充血 (OCULUS K5M) 結膜充血は、OCULUS K5M を使用して評価されます。 患者は、器具の前に快適に座り、ターゲットを真正面から固定します。 画像を撮影し、結膜充血の概要表示を「JENVIS Grading Scale」で評価します。 JENVIS スケール範囲は 0 ～ 4 です。

赤みの値 定義 0 所見なし。 乳幼児

1. 単回注射 成人基準値
2. 軽度の拡散注射
3. 重度の局所注射
4. 重度のびまん性注射

マイクロバイオームの収集 マイクロバイオームの 2 つの標本が両眼から収集されます。 最初に、保存されていないテトラカインを一滴、結膜円蓋に注入します。 刺すような感覚がなくなったら、滅菌綿を交換して、穏やかなローリング アクション (最大 8 ストローク) を使用して、下部結膜円蓋から微生物を収集します。 次に、反対側の目についても手順を繰り返します。

次に、これらのスワップを DNA/RNA Shield (Zymo) 試薬に浸し、すぐに 1 分間ホモジナイズし、30 秒で停止し、氷上で 1 分間維持し、さらに 30 秒間ホモジナイズします。 ホモジナイズされたサンプルは 4°C で保存されます。 これにより、目的に最適かつ十分な DNA/RNA 収量が得られます。 その後の核酸抽出、PCR、配列決定、およびバイオインフォマティクスの手順は、協力者によって実行されます。

保管: 1 年以内、5 年以内に分析することを意図しています。

角膜フルオレセイン染色 (OCULUS K5M) 通常の生理食塩水をフルオレセイン ストリップ (Fluorets) に滴下し、目に見える滴が残らないように振り落とします。 被験者は、蛍光灯を下結膜円蓋に導入する前に、右目と左目で見上げるように求められます。 角膜フルオレセイン染色は、Keratograph 5M によって画像化されます。 採点システムはCCLRUに基づきます。 簡単に言えば、5つの角膜ゾーンがあります。 染色スケールは 0 ～ 4 で、各ゾーンに 0.5 単位のステップがあります。 最後に、フルオレセイン染色された角膜の写真が撮影されます。

Schirmers I テスト これは、SERI で現在使用されている標準ストリップ (折り畳み用のノッチ付き幅 5 mm) (Schirmer Tear Test Strips、クレメント クラーク インターナショナル、英国) で行われます。 事前の麻酔は使用しません。 ストリップは、両眼の眼瞼下縁の側頭下半分に同時に配置されます。 研究参加者は目を閉じるように求められます。 過度の刺激の兆候があれば記録します。 各ストリップの濡れの程度は、5 分間のテスト後に記録されます。 ストリップを収集し、さらに分析するまで-80℃で1.5mlのエッペンドルフチューブに保存します。