Mikrobiom powierzchni oka u pacjentów z zespołem suchego oka

Powierzchnia oka jest pierwszą linią obrony oka, dlatego wykrywane są zagrożenia zewnętrzne i neutralizowane potencjalne urazy. W trakcie ewolucji różne drobnoustroje, zwłaszcza bakterie, zaczęły kolonizować powierzchnię oka jako komensale. Komensale odgrywają rolę w utrzymaniu homeostazy powierzchni oka. 1 Wrodzona odporność powierzchni oka jest bardzo aktywna i składa się z aktywnych mechanizmów hamujących stany zapalne 2. Istnieją na przykład makrofagi, komórki dendrytyczne, komórki supresorowe, komórki regulatorowe, limfocyty B, IgA, lizozym, peptydy przeciwdrobnoustrojowe i bariery przed czynnikami zewnętrznymi. Normalne komensale powierzchni oka utrzymują podstawowy poziom aktywacji wrodzonej obrony poprzez stymulację receptorów rozpoznawania wzorców na komórkach nabłonka powierzchni oka. Ten normalny skład drobnoustrojów jest ważny, ponieważ stan zapalny i infekcja wystąpią, jeśli zostanie wprowadzony szczep patogenny, który pokona florę bakteryjną, lub jeśli szczep dominujący wydziela nadmiernie immunogenne produkty, takie jak egzotoksyna A Staphylococcus, która wywołuje zapalenie rogówki brzeżnej, formę nadwrażliwości typu IV. Obciążenie mikrobiomem florą może również wpływać na funkcję łez, ponieważ stwierdzono, że większe obciążenie florą jest związane ze zwiększoną degradacją mucyny 3 i zmniejszoną gęstością komórek globu 4. Wcześniejsze badania [nie jestem pewien, które to badania] w SERI/SNEC również zwrócić uwagę na znaczenie drobnoustrojów. Na przykład u pacjentów z zespołem suchego oka we łzach występuje zwiększone stężenie lizofosfolipidów, co może przyczyniać się do powstawania mediatorów stanu zapalnego, takich jak kwas arachidonowy i inne metabolity. Lizofosfolipidy powstają w reakcjach fosfolipazy A2, a ta ostatnia może być pochodzenia mikrobiologicznego. Ponieważ zespół suchego oka jest znaną chorobą zapalną powierzchni oka, jest to jeden ze sposobów, w jaki drobnoustroje mogą przyczyniać się do patologii.

Mikrobiom to suma drobnoustrojów znajdujących się w danym miejscu ciała. W oku mikrobiom można badać nieinwazyjnie ze względu na dostępne położenie powierzchni oka. Pomimo znaczenia mikrobiomu powierzchni oka zrozumienie tego tematu jest bardzo powierzchowne iw dużej mierze opiera się na metodach hodowli5-10. Może to być mylące, ponieważ niektóre drobnoustroje nie są tak podatne na rutynowe hodowle komórkowe, a ich obecność może być niewykryta lub ich reprezentacja jest niedoszacowana 11. Niedawno opracowane sekwencjonowanie metagenomiczne, w porównaniu z kulturami, jest korzystne, aby uzyskać obiektywny obraz mikrobiomu11.

Trzy wcześniejsze badania oceniały profile mikrobiomu powierzchni oka za pomocą sekwencjonowania metagenomicznego 16s rRNA 4, 12 13. Zaobserwowano różnice w mikrobiomie między osobami z suchością oczu lub zapaleniem powiek a osobami zdrowymi. Ponadto odkryto znacznie większe zróżnicowanie flory oka w porównaniu z wynikami opartymi na hodowli bakteryjnej.

Szkoła biologii chemicznej i środowiskowej na Uniwersytecie Technologicznym Nanyang oceniła mikrobiomy przy użyciu takich technik. Podstawą tego jest to, że organizmy prokariotyczne mają unikalne sygnatury DNA, które zazwyczaj charakteryzują gatunek pochodzenia, a względną częstość występowania organizmów różnych gatunków można wywnioskować ze względnej obfitości wykrytego DNA. Globalny projekt ludzkiego mikrobiomu ma na celu poznanie mikrobiomu w różnych częściach ludzkiego ciała. Najlepiej można to zrozumieć w jelicie, ale publikacje dotyczące powierzchni oka jeszcze się nie pojawiły.

Niedawno nasi współpracownicy odkryli, że 3 bakterie dominowały na powierzchni oka. Są to Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans i Lactobacillus rhamnosus. Ta dominacja 3 rodzajów bakterii była nieoczekiwana, ponieważ dominujący pogląd na komensale powierzchni oka jest taki, że dominuje koagulazo-ujemny Staphylococcus, a następnie Staphylococcus aureus i Streptococcus, z mniejszą liczbą bakterii Gram-ujemnych i niektóre Propionibacter spp 11. Wśród 3 gatunków Klebsiella pneumonia jest znanym Gram-ujemnym patogenem, który może powodować zakaźne zapalenie rogówki, aw niektórych przypadkach zapalenie wnętrza gałki ocznej. Role Pseudoalteromonas i Lactobacillus są całkowicie nieznane. Ta pierwsza to niepatogenna, wolnożyjąca bakteria Gram-ujemna, o której wiadomo, że występuje w środowisku morskim. Co zaskakujące, wysokie poziomy 3 dominujących bakterii są stosunkowo stałe wśród 3 uczestników będących ludźmi, co sugeruje pewną jednolitość w kolonizacji powierzchni oka przez główne drobnoustroje bakteryjne u osób zdrowych.

Mikrobiom powierzchni oka można badać przez sterylną wymianę sklepienia dolnego spojówki, a następnie homogenizację i ekstrakcję DNA. Obecność DNA bakterii nie informuje o funkcji drobnoustrojów, ponieważ nawet martwe i nienamnażające się organizmy posiadają pozostałości DNA. Technika pobierania próbek może również dostarczyć RNA, a dzięki PCR z odwrotną transkrypcją możliwe jest określenie obecności określonych transkryptów drobnoustrojów, które znajdują się na powierzchni oka. Ponadto nasi współpracownicy z Politechniki Nanyang byli pionierami technik spektrometrii mas MALDI TOF, które umożliwiają charakteryzację proteomów bakteryjnych w oparciu o identyfikację unikalnych sekwencji peptydów bakteryjnych. Łącznie te techniki badań transkryptów i białek bakterii pozwalają na ocenę ekspresji genów i do pewnego stopnia stanu funkcjonalnego odkrytych bakterii. Byłoby to niezwykle istotne w przypadku drobnoustrojów, których wcześniej nie wykryto na powierzchni oka.

Oprócz oczywistego postępu akademickiego i naukowego, projekt ten ma również implikacje medyczne i potencjalną nową własność intelektualną do zastosowań komercyjnych. Po pierwsze, zrozumienie mikrobiomu jest pierwszym krokiem w leczeniu niektórych rodzajów chorób, takich jak zapalenie rogówki brzeżnej i nietypowe zakaźne zapalenie rogówki. Sugeruje, w jaki sposób można manipulować układem odpornościowym w celu leczenia. Po drugie, zapobieganie chorobom i stanom zapalnym można osiągnąć poprzez podawanie probiotyków żywych drobnoustrojów w celu skolonizowania powierzchni oka. Po trzecie, badanie może prowadzić do nowych technik i testów, które identyfikują drobnoustroje i ich składniki, które można przekształcić w kliniczne testy diagnostyczne.

Mamy kilku współpracowników z branży, którzy są zainteresowani współpracą z nami w celu opracowania niektórych z tych pomysłów.

1. CELE

Naszym celem jest przeprowadzenie badania eksploracyjnego w celu:

1. Określenie składu mikrobiomu bakteryjnego powierzchni oka ludzkiego u zdrowych ochotników i pacjentów z zespołem suchego oka
2. Określenie ekspresji genów bakteryjnych (transkryptów bakteryjnych) znajdujących się na powierzchni ludzkiego oka.
3. Scharakteryzuj każdą cechę mikrobiomu, która może być powiązana z cechami klinicznymi, takimi jak wiek, stan filmu łzowego, dysfunkcja gruczołów Meiboma, ekspozycja na bodźce środowiskowe, takie jak palenie itp.

2. OCZEKIWANE KORZYŚCI I KORZYŚCI Oczekiwane ryzyko W przypadku tego badania nie przewiduje się żadnych potencjalnych problemów. Jednak podczas pobierania mikrobiomu z dolnego sklepienia spojówki wystąpi pewien dyskomfort. Pacjentowi zostanie podana niekonserwująca tetrakaina, aby zminimalizować dyskomfort. Podczas testu Schimersa I pojawi się również lekki dyskomfort.

Potencjalne korzyści Dzięki lepszemu zrozumieniu obecności różnych mikrobiomów na powierzchni oka możemy uzyskać lepszy wgląd w zachodzący złożony proces.

3. BADANA POPULACJA 3.1. Podaj liczbę i rodzaj przedmiotów, które mają być zapisane. 90 pacjentów zostanie zwerbowanych z kliniki suchego oka SNEC i kliniki ogólnej obsługiwanych przez głównego badacza. 45 osób bez objawów suchego oka zostanie zwerbowanych jako normalna grupa kontrolna, a 45 osób z objawowym suchym okiem zostanie zrekrutowanych jako osoby z suchym okiem.

3.2. Kryteria rekrutacji i proces rekrutacji

1. Aby rekrutować normalne grupy kontrolne – wszystkie 8 pytań dotyczących objawów suchego oka musi być wolne od objawów suchego oka na etapie wstępnej selekcji. (Dodatek 1) Kwestionariusz zmodyfikowany za Schein et al., 1997. Rekrutacja pacjentów z zespołem suchego oka — co najmniej jedno z 8 pytań dotyczących objawów zespołu suchego oka musi być ≥ stopnia 3
2. Osoby badane spełniają wszystkie kryteria włączenia wymienione poniżej.
3. Wyczyść kryteria wykluczenia. Przed rekrutacją pacjentów należy uzyskać pozwolenie od lekarzy prowadzących. Kwalifikujący się uczestnicy otrzymają poradę dotyczącą badania przez koordynatora badania. Jeśli pacjent jest zainteresowany, koordynator badania będzie towarzyszył mu na poziomie SERI 5 w celu dokonania odpowiednich ocen. Świadoma pisemna zgoda zostanie uzyskana od wszystkich uczestników.

3.3. Kryteria przyjęcia

Uczestnik musi spełniać wszystkie kryteria włączenia, aby wziąć udział w tym badaniu.

1. Uczestnicy muszą mieć ukończone 21 lat
2. Chęć wykonania wszystkich badań okulistycznych w tym badaniu

3.4. Kryteria wyłączenia

Wszyscy uczestnicy spełniający którekolwiek z kryteriów wykluczenia na początku badania zostaną wykluczeni z udziału.

1. Znana historia chorób tarczycy (zdiagnozowana przez lekarza).
2. Znana historia zespołu Sjögrena lub reumatoidalnego zapalenia stawów (zdiagnozowanego przez lekarza).
3. Brak operacji okulistycznych w ciągu ostatnich 3 miesięcy i LASIK w ciągu 1 roku.
4. Choroby powierzchni oka, takie jak skrzydlik lub oczywista choroba powiek/oczodołu z niedomykami powiek.
5. Każdy inny określony powód określony przez badacza klinicznego.

4. PROJEKT BADANIA I PROCEDURY/METODOLOGIA

Projekt badania:

Obserwacyjne - badanie przekrojowe

Liczba wizyt:

W tym badaniu będzie tylko 1 wizyta.

Czas trwania nauki:

1 rok

Procedury:

Zbiór historii medycznej i kwestionariusz suchego oka Będzie dostępny kwestionariusz składający się z historii medycznej i standardowego zestawu kwestionariuszy suchego oka, który identyfikuje takie czynniki, jak używanie soczewek kontaktowych, palenie tytoniu, zawód itp.

Nieinwazyjny czas przerywania łez (OCULUS K5M) Nieinwazyjny czas przerywania łez jest mierzony nieinwazyjnie iw pełni automatycznie za pomocą OCULUS K5M. Nowe oświetlenie w podczerwieni nie jest widoczne dla ludzkiego oka. Zapobiega to odblaskom podczas badania. Pacjent usiądzie wygodnie przed instrumentem i swobodnie mruga, skupiając się na celu znajdującym się bezpośrednio przed nim. Gdy uczestnik będzie gotowy, zostanie poinstruowany, aby mrugnął dwukrotnie i powstrzymał się od mrugania. Keratograf 5M jest w pełni zautomatyzowany i wychwyci każdą przerwę lub zniekształcenie obrazu, a czas wystąpienia przerwy zostanie odnotowany. Dla każdego oka zostaną wykonane trzy odczyty, aby uzyskać średnią wartość.

Zaczerwienienie spojówek (OCULUS K5M) Zaczerwienienie spojówek zostanie ocenione za pomocą OCULUS K5M. Pacjent usiądzie wygodnie przed instrumentem, jednocześnie skupiając się na celu znajdującym się bezpośrednio przed nim. Obraz zostanie przechwycony, a ogólny obraz zaczerwienienia spojówek zostanie oceniony za pomocą „Skali oceny JENVIS”. Zakres skali JENVIS od 0 do 4.

Wartość zaczerwienienia Definicja 0 Brak ustaleń, np. Niemowlęta lub niemowlęta

1. Pojedyncze wstrzyknięcia, standardowa wartość dla dorosłych
2. Łagodne rozproszone zastrzyki
3. Ciężkie miejscowe zastrzyki
4. Ciężkie rozproszone zastrzyki

Pobieranie mikrobiomu Z obu oczu zostaną pobrane dwie próbki mikrobiomu. Po pierwsze: kropla niezakonserwowanej tetrakainy zostanie wkroplona do sklepienia spojówki. Po ustąpieniu uczucia pieczenia sterylny bawełniany wacik zostanie użyty do zebrania drobnoustrojów z dolnego sklepienia spojówki za pomocą delikatnego obracania (do 8 pociągnięć). Następnie procedurę powtarza się dla przeciwnego oka.

Te zamiany zostaną następnie namoczone w odczynniku DNA/RNA Shield (Zymo) i natychmiast homogenizowane przez 1 minutę, zatrzymane na 30 sekund i trzymane w lodzie przez 1 minutę, a następnie homogenizowane przez kolejne 30 sekund. Homogenizowane próbki będą przechowywane w temperaturze 4°C. Zapewnia to optymalny i wystarczający do naszych celów uzysk DNA/RNA. Późniejsza ekstrakcja kwasów nukleinowych, PCR, sekwencjonowanie i procedury bioinformatyczne będą wykonywane przez naszych współpracowników.

Przechowywanie: przeznaczone do analizy w ciągu roku, nie dłużej niż 5 lat.

Barwienie rogówki fluoresceiną (OCULUS K5M) Na pasek z fluoresceiną (Fluorets) zostanie wkroplona kropla normalnej soli fizjologicznej, a następnie strząśnięta, aby nie pozostała żadna widoczna kropla. Pacjent jest proszony o spojrzenie w górę przed wprowadzeniem fluoretu do dolnego sklepienia spojówki prawego, a następnie lewego oka. Barwienie rogówki fluoresceiną zostanie zobrazowane za pomocą Keratografu 5M. System punktacji będzie oparty na CCLRU. Krótko mówiąc, będzie 5 stref rogówki. Skala barwienia wynosi 0-4, z krokiem jednostkowym 0,5 w każdej ze stref. Na koniec zostanie zrobione zdjęcie rogówki wybarwionej fluoresceiną.

Test Schirmersa I Zostanie to wykonane przy użyciu standardowych pasków stosowanych obecnie w SERI (szerokość 5 mm z wycięciem do złożenia) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, Wielka Brytania). Nie będzie stosowane żadne wcześniejsze znieczulenie. Paski zostaną umieszczone nad dolną skroniową połową krawędzi dolnej powieki w obu oczach w tym samym czasie. Uczestnik badania zostanie poproszony o zamknięcie oczu. Wszelkie oznaki nadmiernego podrażnienia zostaną odnotowane. Stopień zwilżenia każdego paska będzie rejestrowany po 5 minutach badania. Pasek zostanie zebrany i przechowywany w probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml w temperaturze -80˚C do czasu dalszej analizy.