Microbiome de la surface oculaire chez les patients atteints de sécheresse oculaire

La surface oculaire est la première ligne de défense de l'œil, c'est donc là que les menaces extérieures sont captées, et les agressions potentielles neutralisées. Au cours de l'évolution, divers microbes, notamment des bactéries, sont venus coloniser la surface oculaire en tant que commensaux. Les commensaux ont pour rôle de maintenir l'homéostasie de la surface oculaire. 1 L'immunité innée de la surface oculaire est très active et consiste en des mécanismes actifs pour supprimer l'inflammation 2. Par exemple, il existe des macrophages, des cellules dendritiques, des cellules suppressives, des cellules régulatrices, des cellules B, des IgA, du lysozyme, des peptides antimicrobiens et barrières contre les agents extérieurs. Les commensaux normaux de la surface oculaire maintiennent un niveau basal d'activation de la défense innée en stimulant les récepteurs de reconnaissance de formes sur les cellules épithéliales de la surface oculaire. Cette composition normale de microbes est importante car il en résultera une inflammation et une infection s'il y a introduction d'une souche pathogène qui surmonte la flore, ou si une souche dominante sécrète des produits trop immunogènes, comme l'exotoxine A de Staphylococcus qui déclenche une kératite marginale, une forme d'hypersensibilité de type IV. La charge de flore du microbiome pourrait également influencer la fonction lacrymale, car une charge de flore plus élevée s'est avérée associée à une dégradation accrue de la mucine 3 et à une densité de cellules globettes réduite 4. souligner l'importance des microbes. Par exemple, chez les patients atteints de sécheresse oculaire, il y a une augmentation des lysophospholipides dans la déchirure, ce qui peut contribuer aux médiateurs inflammatoires tels que l'acide arachidonique et d'autres métabolites. Les lysophospholipides sont formés par les réactions de la phospholipase A2, et cette dernière peut être d'origine microbienne. Étant donné que la sécheresse oculaire est une maladie inflammatoire connue de la surface oculaire, c'est l'une des façons dont les microbes peuvent contribuer à la pathologie.

Le microbiome est la somme totale du microbe trouvé dans un endroit du corps. Dans l'œil, le microbiome peut être étudié de manière non invasive en raison de l'emplacement accessible de la surface oculaire. Malgré l'importance du microbiome de la surface oculaire, la compréhension de ce sujet est très superficielle et largement basée sur les méthodes de culture5-10. Cela peut être trompeur car certains des microbes ne se prêtent pas tellement aux cultures cellulaires de routine et leur présence peut ne pas être détectée ou leur représentation sous-estimée 11. Le séquençage métagénomique récemment développé, par rapport aux cultures, est avantageux pour obtenir une vision non biaisée du microbiome11.

Trois études antérieures ont évalué les profils de microbiome de la surface oculaire avec le séquençage métagénomique de l'ARNr 16s 4, 12 13. Des différences de microbiome ont été observées entre les sujets souffrant de sécheresse oculaire ou de blépharite et les sujets sains. De plus, une bien plus grande diversité de la flore oculaire a été découverte par rapport aux résultats basés sur la culture bactérienne.

L'école des sciences de la vie chimiques et environnementales de l'Université technologique de Nanyang a évalué les microbiomes à l'aide de ces techniques. La base de ceci est que les organismes procaryotes ont des signatures d'ADN uniques qui peuvent typiquement caractériser l'espèce d'origine, et la prévalence relative des organismes de différentes espèces peut être déduite de l'abondance relative des différents ADN détectés. Le projet mondial sur le microbiome humain cherche à comprendre le microbiome dans différentes parties du corps humain. Ceci est mieux compris dans l'intestin, mais les publications sur la surface oculaire n'ont pas encore vu le jour.

Récemment, nos collaborateurs ont découvert que 3 bactéries dominaient la surface oculaire de l'œil. Il s'agit de Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans et Lactobacillus rhamnosus. Cette dominance de 3 types de bactéries était inattendue, car la vision dominante des commensaux de la surface oculaire est que Staphylococcus à coagulase négative domine, suivi par Staphylococcus aureus et Streptococcus, avec moins de bactéries à Gram négatif, et certains Propionibacter spp 11. Parmi les 3 espèces, Klebsiella pneumonia est un pathogène gram négatif connu qui peut provoquer une kératite infectieuse, et dans certains cas une endophtalmie. Les rôles de Pseudoalteromonas et Lactobacillus sont totalement inconnus. La première est une bactérie gram négative vivante libre non pathogène connue pour être présente dans les milieux marins. Étonnamment, les niveaux élevés des 3 bactéries prédominantes sont relativement constants parmi les 3 participants humains, suggérant une certaine uniformité dans la colonisation de la surface oculaire par les principaux microbes bactériens chez les individus non malades.

Le microbiome de la surface oculaire peut être étudié par échange stérile du fornix inférieur de la conjonctive suivi d'une homogénéisation et d'une extraction d'ADN. La présence d'ADN bactérien n'informe pas sur la fonction des microbes, puisque même les organismes morts et non proliférants ont de l'ADN résiduel. La technique de collecte d'échantillons peut également produire de l'ARN, et à partir de la PCR de transcription inverse, il est possible de déterminer la présence de transcrits microbiens spécifiques qui se trouvent dans la surface oculaire. De plus, nos collaborateurs de Nanyang Polytechnic ont été les pionniers des techniques de spectrométrie de masse MALDI TOF qui permettent la caractérisation des protéomes bactériens, basée sur l'identification de séquences peptidiques bactériennes uniques. Ensemble, ces techniques d'investigation des transcriptions bactériennes et des protéines permettent d'évaluer l'expression des gènes et, dans une certaine mesure, l'état fonctionnel des bactéries découvertes. Cela serait extrêmement important dans le cas de microbes qui n'ont pas été découverts auparavant sur la surface oculaire.

Outre l'avancée académique et scientifique évidente, ce projet a également des implications médicales et une nouvelle propriété intellectuelle potentielle pour des applications commerciales. Premièrement, la compréhension du microbiome est la première étape pour traiter certains types de maladies telles que la kératite marginale et la kératite infectieuse inhabituelle. Il suggère comment le système immunitaire peut être manipulé pour le traitement. Deuxièmement, la prévention des maladies et de l'inflammation peut être obtenue par l'administration probiotique de microbes vivants pour coloniser la surface oculaire. Troisièmement, l'étude peut conduire à de nouvelles techniques et à de nouveaux tests qui identifient les microbes et leurs composants qui peuvent être développés dans des tests de diagnostic clinique.

Nous avons des collaborateurs de l'industrie qui souhaitent s'associer à nous pour développer certaines de ces idées.

1. OBJECTIFS

Nous visons à mener une étude exploratoire pour :

1. Déterminer la composition du microbiome bactérien de la surface oculaire humaine chez des volontaires normaux et des patients atteints de sécheresse oculaire
2. Déterminer l'expression des gènes bactériens (transcrits bactériens) trouvés dans la surface oculaire humaine.
3. Caractériser toute caractéristique du microbiome pouvant être liée à des caractéristiques cliniques telles que l'âge, l'état du film lacrymal, le dysfonctionnement des glandes de Meibomius, l'exposition à des stimulations environnementales telles que le tabagisme, etc.

2. RISQUES ET AVANTAGES ATTENDUS Risques attendus Aucun problème potentiel n'est attendu pour cette étude. Cependant, il y aura un léger inconfort lors de la collecte du microbiome du cul-de-sac conjonctival inférieur. De la tétracaïne sans conservateur sera administrée au patient pour minimiser tout inconfort. Il y aura également un léger inconfort lors du test Schimers I.

Avantages potentiels Avec une meilleure compréhension de la présence de divers microbiomes dans la surface oculaire, nous pouvons mieux comprendre le processus complexe en cours.

3. POPULATION ÉTUDIÉE 3.1. Indiquez le nombre et la nature des matières à inscrire. 90 sujets seront recrutés à partir de la clinique des yeux secs du SNEC et de la clinique générale desservies par le chercheur principal. 45 sujets sans symptômes de sécheresse oculaire seront recrutés comme témoins normaux et 45 sujets présentant des symptômes de sécheresse oculaire seront recrutés comme sujets de sécheresse oculaire.

3.2. Critères de recrutement et processus de recrutement

1. Pour recruter des témoins normaux - Toutes les 8 questions sur les symptômes de sécheresse oculaire doivent être exemptes de symptômes de sécheresse oculaire lors de la phase de présélection. (Annexe 1) Questionnaire modifié d'après Schein et al.,1997. Pour recruter des sujets de sécheresse oculaire - Au moins une des 8 questions sur les symptômes de la sécheresse oculaire doit être ≥ grade 3
2. Les sujets répondent à tous les critères d'inclusion énumérés ci-dessous.
3. Sans critères d'exclusion. L'autorisation serait demandée aux médecins traitants avant le recrutement des sujets. Les sujets éligibles seront conseillés sur l'étude par le coordinateur de l'étude. Si le sujet est intéressé, le coordinateur d'études accompagnera ensuite le sujet au niveau 5 du SEFRI pour les évaluations correspondantes. Un consentement écrit éclairé sera obtenu de tous les participants.

3.3. Critère d'intégration

Le sujet doit répondre à tous les critères d'inclusion pour participer à cette étude.

1. Les sujets doivent avoir 21 ans ou plus
2. Disposé à effectuer tous les examens de la vue dans cette étude

3.4. Critère d'exclusion

Tous les sujets répondant à l'un des critères d'exclusion au départ seront exclus de la participation.

1. Antécédents connus de troubles thyroïdiens (diagnostiqués par un médecin).
2. Antécédents connus de syndrome de Sjögren ou de polyarthrite rhumatoïde (diagnostiqué par un médecin).
3. Pas de chirurgie oculaire dans les 3 derniers mois et LASIK dans 1 an.
4. Maladies de la surface oculaire telles que ptérygion, ou maladie palpébrale/orbitaire évidente avec lagophtalmie.
5. Toute autre raison spécifiée telle que déterminée par l'investigateur clinique.

4. CONCEPTION ET PROCÉDURES/MÉTHODOLOGIE DE L'ÉTUDE

Étudier le design:

Observationnelle - Étude transversale

Nombre de visites :

Il n'y aura qu'une seule visite dans cette étude.

Durée de l'étude :

1 année

Procédures:

Collecte des antécédents médicaux et questionnaire sur la sécheresse oculaire Il y aura un questionnaire qui comprend les antécédents médicaux et un ensemble standard de questionnaires sur la sécheresse oculaire qui identifie des facteurs tels que l'utilisation de lentilles de contact, le tabagisme, la profession, etc.

Temps de rupture de déchirure non invasif (OCULUS K5M) Le temps de rupture de déchirure non invasif est mesuré de manière non invasive et entièrement automatique à l'aide d'OCULUS K5M. Le nouvel éclairage infrarouge n'est pas visible à l'œil humain. Cela évite l'éblouissement pendant l'examen. Le patient s'assiéra confortablement devant l'instrument et clignera des yeux librement tout en se fixant sur une cible directement devant lui. Une fois que le participant est prêt, il lui sera demandé de cligner des yeux deux fois et de s'abstenir de cligner des yeux. Le kératographe 5M est entièrement automatisé et il capturera toute rupture ou distorsion de l'image et l'heure de la rupture sera notée. Trois lectures seront prises pour chaque œil pour obtenir la valeur moyenne.

Rougeur de la conjonctive (OCULUS K5M) La rougeur de la conjonctive sera évaluée à l'aide de l'OCULUS K5M. Le patient s'assoira confortablement devant l'instrument tout en se fixant sur une cible directement devant lui. L'image sera capturée et un affichage d'ensemble de la rougeur de la conjonctive sera évalué par "JENVIS Grading Scale". L'échelle JENVIS va de 0 à 4.

Indice de rougeur Définition 0 Aucun résultat, par ex. Bébés ou nourrissons

1. Injections uniques, valeur standard pour adultes
2. Injections diffuses légères
3. Injections locales sévères
4. Injections diffuses sévères

Collecte de microbiome Deux échantillons de microbiome seront prélevés des deux yeux. Premièrement : une goutte de tétracaïne sans conservateur sera instillée dans le fornix conjonctival. Une fois la sensation de picotement résolue, un tampon de coton stérile sera utilisé pour collecter les microbes du fornix conjonctival inférieur en utilisant une action de roulement doux (jusqu'à 8 coups). La procédure est ensuite répétée pour l'œil opposé.

Ces swaps seront ensuite trempés dans le réactif DNA/RNA Shield (Zymo) et immédiatement homogénéisés pendant 1 minute, arrêtés à 30 secondes et conservés sur glace pendant 1 minute, et homogénéisés pendant 30 secondes supplémentaires. Les échantillons homogénéisés seront conservés à 4°C. Cela garantit un rendement optimal et suffisant d'ADN/ARN pour notre objectif. Les procédures ultérieures d'extraction d'acide nucléique, de PCR, de séquençage et de bioinformatique seront effectuées par nos collaborateurs.

Stockage : destiné à être analysé dans un délai d'un an, pas plus de 5 ans.

Coloration cornéenne à la fluorescéine (OCULUS K5M) Une goutte de solution saline normale sera instillée sur la bandelette de fluorescéine (Fluorets) puis secouée afin qu'il ne reste aucune goutte visible. Le sujet est invité à lever les yeux avant l'introduction du fluoret dans le fornix conjonctival inférieur de l'œil droit puis gauche. La coloration cornéenne à la fluorescéine sera imagée par le kératographe 5M. Le système de notation sera basé sur le CCLRU. Brièvement, il y aura 5 zones cornéennes. L'échelle de coloration est de 0 à 4, avec des pas d'unité de 0,5 dans chacune des zones. Enfin, une photo de la cornée colorée à la fluorescéine sera prise.

Test de Schirmers I Cela sera fait avec les bandes standard actuellement utilisées au SERI (5 mm de large avec une encoche pour le pliage) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, UK). Aucun anesthésique préalable ne sera utilisé. Les bandelettes seront positionnées sur la moitié temporale inférieure du bord de la paupière inférieure dans les deux yeux en même temps. Le participant à l'étude sera invité à fermer les yeux. Tout signe d'irritation excessive sera noté. L'étendue du mouillage dans chaque bande sera enregistrée après 5 minutes de test. La bandelette sera collectée et stockée dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml à -80 °C jusqu'à une analyse plus approfondie.