Øjenoverflademikrobiom hos patienter med tørre øjne

Den okulære overflade er øjets første forsvarslinje, det er derfor, hvor ydre trusler fornemmes, og potentielle fornærmelser neutraliseres. I løbet af evolutionen er forskellige mikrober, især bakterier, kommet til at kolonisere den okulære overflade som kommensaler. Kommensalerne har en rolle i at opretholde homeostasen af ​​den okulære overflade. 1 Den medfødte immunitet af den okulære overflade er meget aktiv, og består af aktive mekanismer til at undertrykke inflammation 2. Der findes f.eks. makrofager, dendritiske celler, suppressorceller, regulatoriske celler, B-celler, IgA, lysozym, antimikrobielle peptider og barrierer mod eksterne agenter. De normale kommensaler af den okulære overflade opretholder et basalt niveau af aktivering af medfødt forsvar ved at stimulere mønstergenkendelsesreceptorerne på okulære overfladeepitelceller. Denne normale sammensætning af mikrober er vigtig, da inflammation og infektion vil opstå, hvis der er introduktion af en patogen stamme, der overvinder floraen, eller hvis en dominerende stamme udskiller overdrevent immunogene produkter, såsom exotoksin A fra Staphylococcus, som udløser marginal keratitis, en form af type IV overfølsomhed. Florabelastningen af ​​mikrobiom kunne også påvirke tårefunktionen, da en højere florabelastning viste sig at være forbundet med øget mucinnedbrydning 3 og reduceret globetcelletæthed 4. Tidligere undersøgelser [Jeg er ikke sikker på, hvilke undersøgelser disse er] hos SERI/SNEC også pege på vigtigheden af ​​mikrober. For eksempel er der hos patienter med tørre øjne øget lysophospholipider i tåren, og dette kan bidrage til inflammatoriske mediatorer såsom arachidonsyre og andre metabolitter. Lysophospholipiderne dannes af phospholipase A2-reaktioner, og sidstnævnte kan være af mikrobiel oprindelse. Da tørre øjne er en kendt inflammatorisk sygdom i øjets overflade, er dette en måde, hvorpå mikrober kan bidrage til patologien.

Mikrobiomet er summen af ​​mikroben fundet på en kropsplacering. I øjet kan mikrobiomet undersøges non-invasivt på grund af den tilgængelige placering af den okulære overflade. På trods af vigtigheden af ​​det okulære overflademikrobiom er forståelsen af ​​dette emne meget overfladisk og i høj grad baseret på dyrkningsmetoder5-10. Dette kan være vildledende, fordi nogle af mikroberne ikke er så modtagelige for rutinemæssige cellekulturer, og deres tilstedeværelse kan være uopdaget eller deres repræsentation undervurderet 11. Nyligt udviklet metagenomisk sekventering, sammenlignet med kulturer, er fordelagtige for at få et upartisk syn på mikrobiom11.

Tre tidligere undersøgelser har evalueret mikrobiomprofilerne af den okulære overflade med metagenomisk sekventering af 16s rRNA 4, 12 13. Forskelle i mikrobiom blev observeret mellem forsøgspersoner med tørre øjne eller blepharitis og raske forsøgspersoner. Desuden blev der opdaget en meget større mangfoldighed af øjenflora sammenlignet med resultater baseret på bakteriekultur.

Skolen for kemisk og miljømæssig biovidenskab ved Nanyang Technological University har evalueret mikrobiomer ved hjælp af sådanne teknikker. Grundlaget for dette er, at prokaryote organismer har unikke DNA-signaturer, som typisk kan karakterisere oprindelsesarten, og den relative udbredelse af organismerne af forskellige arter kan udledes af den relative mængde af de forskellige DNA, der er påvist. Det globale menneskelige mikrobiom-projekt søger at forstå mikrobiomet i forskellige dele af den menneskelige krop. Dette er bedst forstået i tarmen, men publikationer om den okulære overflade er endnu ikke dukket op.

For nylig har vores samarbejdspartnere vist sig, at 3 bakterier dominerede den okulære overflade af øjet. Disse er Klebsiella pneumoniae, Pseudoalteromonas agarivorans og Lactobacillus rhamnosus. Denne dominans af 3 typer af bakterier var uventet, da det dominerende syn på øjenoverfladekommensaler er, at koagulase-negative Staphylococcus dominerer, efterfulgt af Staphylococcus aureus og Streptococcus, med færre gramnegative bakterier, og nogle Propionibacter spp 11. Blandt de 3 arter er Klebsiella lungebetændelse et kendt gramnegativt patogen, der kan forårsage infektiøs keratitis, og i nogle tilfælde endophthalmitis. Rollerne af Pseudoalteromonas og Lactobacillus er fuldstændig ukendte. Førstnævnte er en ikke-patogen fri levende gramnegativ bakterie, der vides at være til stede i marine omgivelser. Overraskende nok er de høje niveauer af de 3 dominerende bakterier relativt konstante blandt de 3 menneskelige deltagere, hvilket tyder på en vis grad af ensartethed i koloniseringen af ​​den okulære overflade af store bakteriemikrober hos ikke-syge individer.

Det okulære overflademikrobiom kan studeres ved steril udskiftning af den inferior fornix af bindehinden efterfulgt af homogenisering og ekstraktion af DNA. Tilstedeværelsen af ​​bakterie-DNA informerer ikke om mikrobernes funktion, da selv døde og ikke-prolifererende organismer har rest-DNA. Teknikken til at indsamle prøver kan også give RNA, og ud fra revers transkription PCR er det muligt at bestemme tilstedeværelsen af ​​specifikke mikrobielle transkripter, der findes i den okulære overflade. Desuden har vores samarbejdspartnere fra Nanyang Polytechnic været banebrydende med MALDI TOF-massespektrometriteknikker, der tillader karakterisering af bakterielle proteomer, baseret på identifikation af unikke bakterielle peptidsekvenser. Sammen tillader disse teknikker til bakterietranskription og proteinundersøgelser evaluering af genekspressionen og til en vis grad funktionel status for de opdagede bakterier. Dette ville være ekstremt vigtigt i tilfælde af mikrober, der ikke tidligere er blevet opdaget på den okulære overflade.

Udover det åbenlyse akademiske og videnskabelige fremskridt har dette projekt også medicinske implikationer og potentiel ny intellektuel ejendomsret til kommercielle applikationer. For det første er forståelsen af ​​mikrobiomet det første skridt til at behandle visse typer sygdomme såsom marginal keratitis og usædvanlig infektiøs keratitis. Det foreslår, hvordan immunsystemet kan manipuleres til behandling. For det andet kan forebyggelse af sygdomme og inflammation opnås ved probiotisk administration af levende mikrober for at kolonisere den okulære overflade. For det tredje kan undersøgelsen føre til nye teknikker og assays, der identificerer mikrober og deres komponenter, som kan udvikles til kliniske diagnostiske assays.

Vi har nogle branchesamarbejdspartnere, som er interesserede i at samarbejde med os om at udvikle nogle af disse ideer.

1. MÅL

Vi sigter mod at gennemføre en eksplorativ undersøgelse til:

1. Bestem sammensætningen af ​​det bakterielle mikrobiom af den menneskelige øjenoverflade hos normale frivillige og patienter med tørre øjne
2. Bestem den bakterielle genekspression (bakterielle transkripter) fundet i den menneskelige øjenoverflade.
3. Karakteriser ethvert træk ved mikrobiomet, der kan være forbundet med kliniske karakteristika såsom alder, status for tårefilm, meibomisk kirteldysfunktion, eksponering for miljøstimulering såsom rygning osv.

2. FORVENTEDE RISIKO OG FORDELE Forventede risici Der forventes ingen potentielle problemer for denne undersøgelse. Der vil dog være lidt ubehag under indsamlingen af ​​mikrobiom fra den nedre konjunktivale fornix. Ikke-konserverende tetracain vil blive givet til patienten for at minimere ethvert ubehag. Der vil også være lidt ubehag under Schimers I-testen.

Potentielle fordele Med større forståelse for tilstedeværelsen af ​​forskellige mikrobiomer i den okulære overflade kan vi få yderligere indsigt i den komplekse proces, der finder sted.

3. UNDERSØGELSESBEFOLKNING 3.1. Angiv antallet og arten af ​​fag, der skal tilmeldes. 90 forsøgspersoner vil blive rekrutteret fra SNEC tørøjenklinik og generel klinik serviceret af hovedforskeren. 45 forsøgspersoner uden symptomer på tørre øjne vil blive rekrutteret som normale kontroller, og 45 forsøgspersoner med symptomatisk tørre øjne vil blive rekrutteret som forsøgspersoner med tørre øjne.

3.2. Kriterier for rekruttering og rekrutteringsproces

1. For at rekruttere normale kontroller - Alle de 8 spørgsmål om symptomer på tørre øjne skal være fri for symptomer på tørre øjne under præ-screeningen. (Bilag 1) Spørgeskema modificeret efter Schein et al.,1997. For at rekruttere forsøgspersoner med tørre øjne - Mindst et ud af de 8 spørgsmål om symptomer på tørre øjne skal være ≥ grad 3
2. Emner opfylder alle inklusionskriterierne nedenfor.
3. Klar for eksklusionskriterier. Der ville blive søgt tilladelse fra de behandlende læger, før forsøgspersoner rekrutteres. Støtteberettigede emner vil blive vejledt om undersøgelsen af ​​studiekoordinator. Hvis faget er interesseret, vil studiekoordinatoren herefter ledsage faget til SERI niveau 5 for de relevante vurderinger. Der vil blive indhentet informeret skriftligt samtykke fra alle deltagere.

3.3. Inklusionskriterier

Forsøgspersonen skal opfylde alle inklusionskriterierne for at deltage i denne undersøgelse.

1. Forsøgspersoner skal være 21 år eller ældre
2. Er villig til at udføre alle øjenundersøgelser i denne undersøgelse

3.4. Eksklusionskriterier

Alle forsøgspersoner, der opfylder nogen af ​​udelukkelseskriterierne ved baseline, vil blive udelukket fra deltagelse.

1. Kendt historie med skjoldbruskkirtellidelser (diagnosticeret af læge).
2. Kendt historie med Sjogrens syndrom eller leddegigt (diagnosticeret af læge).
3. Ingen øjenoperation inden for de sidste 3 måneder og LASIK inden for 1 år.
4. Okulære overfladesygdomme såsom pterygium, eller åbenlys låg-/orbitalsygdom med lagophthalmos.
5. Enhver anden specificeret årsag som bestemt af den kliniske investigator.

4. STUDIEDESIGN OG PROCEDURER/METODOLOGI

Studere design:

Observationel - tværsnitsundersøgelse

Antal besøg:

Der vil kun være 1 besøg i denne undersøgelse.

Studiets varighed:

1 år

Procedurer:

Indsamling af sygehistorie og spørgeskema til tørre øjne. Der vil være et spørgeskema, som består af sygehistorie og et standardsæt af spørgeskemaer til tørre øjne, som identificerer faktorer som kontaktlinsebrug, rygning, beskæftigelse mv.

Ikke-invasiv tåreopbrudstid (OCULUS K5M) Non-invasiv tåreopbrudstid måles ikke-invasivt og fuldautomatisk ved hjælp af OCULUS K5M. Den nye infrarøde belysning er ikke synlig for det menneskelige øje. Dette forhindrer blænding under undersøgelsen. Patienten vil sidde komfortabelt foran instrumentet og blinke frit, mens han fikserer på et mål lige foran. Når deltageren er klar, vil de blive bedt om at blinke to gange og undlade at blinke. Keratograph 5M er fuldautomatisk, og den vil fange enhver pause eller forvrængning i billedet, og tidspunktet for pausen vil blive noteret. Der foretages tre aflæsninger for hvert øje for at få gennemsnitsværdien.

Konjunktiva rødme (OCULUS K5M) Konjunktiva rødme vil blive vurderet ved hjælp af OCULUS K5M. Patienten vil sidde komfortabelt foran instrumentet, mens han fikserer sig på et mål lige foran. Billedet vil blive taget, og en oversigtsvisning af rødme i bindehinden vil blive evalueret af "JENVIS Grading Scale". JENVIS skala går fra 0 til 4.

Rødmeværdi Definition 0 Ingen fund, f.eks. Babyer eller spædbørn

1. Enkeltindsprøjtninger, standardværdi for voksne
2. Milde diffuse injektioner
3. Alvorlige lokale injektioner
4. Alvorlige diffuse injektioner

Indsamling af mikrobiom To prøver af mikrobiom vil blive indsamlet fra begge øjne. For det første: en dråbe ikke-konserveret tetracain vil blive dryppet ind i konjunktival fornix. Efter at den stikkende fornemmelse er forsvundet, vil en steril bomuldsswap blive brugt til at opsamle mikroberne fra den nedre konjunktivale fornix ved hjælp af en blid rullende handling (op til 8 slag). Proceduren gentages derefter for det modsatte øje.

Disse swaps vil derefter blive gennemblødt i DNA/RNA Shield (Zymo)-reagens og straks homogeniseres i 1 minut, stoppe ved 30 sekunder og holde på is i 1 minut og homogeniseres i yderligere 30 sekunder. Homogeniserede prøver vil blive opbevaret ved 4°C. Dette sikrer et optimalt og tilstrækkeligt DNA/RNA-udbytte til vores formål. Efterfølgende nukleinsyreekstraktion, PCR, sekventering og bioinformatiske procedurer vil blive udført af vores samarbejdspartnere.

Opbevaring: beregnet til at blive analyseret inden for et år, ikke mere end 5 år.

Hornhindefluoresceinfarvning (OCULUS K5M) En dråbe normalt saltvand dryppes på fluoresceinstrimlen (Fluorets) og rystes derefter af, så der ikke er nogen synlige dråber tilbage. Forsøgspersonen bliver bedt om at slå op før introduktionen af ​​fluoret til inferior conjunctival fornix på højre og derefter venstre øje. Hornhindefluoresceinfarvning vil blive afbildet af Keratograph 5M. Scoringssystem vil være baseret på CCLRU. Kort fortalt vil der være 5 hornhindezoner. Farvningsskalaen er 0-4, med 0,5 enhedstrin i hver af zonerne. Til sidst vil der blive taget et billede af den fluoresceinfarvede hornhinde.

Schirmers I-test Dette vil blive udført med de standardstrimler, der i øjeblikket bruges hos SERI (5 mm brede med et hak til foldning) (Schirmer Tear Test Strips, Clement Clarke International, UK). Der vil ikke blive brugt nogen forudgående bedøvelse. Strimlerne vil blive placeret over den nedre temporale halvdel af den nederste øjenlågsrand i begge øjne på samme tid. Studiedeltageren vil blive bedt om at lukke øjnene. Eventuelle tegn på overdreven irritation vil blive bemærket. Omfanget af befugtningen i hver strimmel vil blive registreret efter 5 minutters test. Strimlen vil blive opsamlet og opbevaret i 1,5 ml eppendorf-rør ved -80˚C indtil videre analyse.